Analityczny kamień milowy, cz.2.

Spektrometr masowy z 1989 roku/ za: www.wikipedia.org; Hannes Grobe (CC BY-SA 2.5) ©2010

ResearchBlogging.org

Wróćmy więc do tematu identyfikacji białek. Pod koniec lat 80. z odsieczą przybyli badacze zajmujący się spektrometrią masową. Spektrometra masowa, jako metoda w pierwszej kolejności określania masy, ma obecnie blisko wiek (w przyszłym roku obchodzić będzie swoje setne urodziny). Nie chcę się rozwodzić nad nią zanadto, bo jedna monografia byłaby zbyt krótka, nawet gdyby zebrać tylko najważniejsze zagadnienia związane ze spektrometrią masową. Ale powiedzmy słów kilka wyjaśnienia, co do tej techniki w ogólności, zanim zacznę Was męczyć szczegółami na temat tego, jak jest ona stosowana do analizy białek.

Spektrometr masowy z 1989 roku/ za: http://www.wikipedia.org; Hannes Grobe (CC BY-SA 2.5) ©2010

Dodam jeszcze, że znakomite artykuły z zakresu spektrometrii mas znajdziecie na wiki zarówno polskiej, jak i angielskiej, dlatego polecam zajrzeć, bo naprawdę trudno wszystko opisać w jednym poście… Ach, i z góry przepraszam za chaotyczny start…

Tak więc schemat prostego eksperymentu z wykorzystaniem spektometrii masowej wygląda następująco: próbkę zawierającą badaną substancję poddaje się jonizacji. Jonizację prowadzić można na wiele sposobów, mniej lub bardziej adekwatnych, w zależności od celu doświadczenia. Najprostszą metodą jonizacji jest bombardowanie analitu (próbki) wiązką elektronów lub jakimiś prostymi cząsteczkami (np. wiązką cząsteczek metanu). Te najprostsze metody są wciąż najefektywniejsze, gdy wykorzystywane do jonizacji prostych molekuł organicznych. W dodatku w czasie tego procesu cząsteczki badane nie tylko – zgodnie z nazwą – zyskują ładunek (dodatni, ujemny, mogą też ulec przekształceniu w wolne rodniki), ale także często ulegają fragmentacji. Ponieważ jednak w zależności od użytej metody, pewne rodzaje wiązań są mniej lub bardziej podatne na degradację, dzięki sposobowi, w jaki cząsteczki rozpadają się pod wpływem na przykład wiązki elektronów, możemy wiele powiedzieć o ich budowie – nie tylko określić ich masę, ale wręcz dokładnie ustalić obecność pewnych elementów strukturalnych.

Kiedy już próbka jest zjonizowana, jony przenoszone są do analizatora, w których następuje ich rozdział pod kątem stosunku masy do ładunku. Ponownie, nad poszczególnymi analizatorami rozwodził się nie będę, odeślę tylko do artykułu w wiki. Dość powiedzieć, że po przebyciu drogi w analizatorze jony trafiają w detektor, a wynik doświadczenia jest widoczny jako tzw. widmo masowe, na którym poszczególne piki rozdzielone są w zależności ich stosunku masy do ładunku.

Spektrum masowe toluenu wyprodukowane z użyciem jonizacji elektronami/ za: http://www.wikipedia.org (dom.publ.)

Jednak w latach 70. i wczesnych 80., gdy białka stały się nagle tak bardzo interesujące – a może nie tyle stały się, ile nagle dowiedzieliśmy się o nich bardzo wiele – spektrometria masowa nie miała wiele do zaoferowania chemii białek. Z kilku prostych powodów.

Po pierwsze, istniejące wówczas metody jonizacji wymagały, aby próbka była w stanie gazowym. Przeprowadzenie w stan gazowy małych organicznych i nierzadko z natury bardzo lotnych substancji to jedna sprawa. Całkiem innym, bardziej skomplikowanym problemem jest przeniesienie w stan gazowy olbrzymich polarnych cząsteczek jakimi są białka. Problem zresztą nie zaczynał się przy białkach – istniejące metody nie radziły sobie nawet ze znacznie mniejszymi i prostszymi peptydami.

Po drugie, istniejące wówczas metody jonizacji były procesami bardzo agresywnymi dla analitu, często prowadząc, jak wspominałem, do jego fragmentacji. W przypadku badania małych cząsteczek jest to nawet zaletą, gdy jednak próbujemy zbadać olbrzymie białko, które w dodatku nie jest zbyt stabilne nawet bez okładania go elektronami, to skończyć się to może tylko w jeden sposób – rozpadem tego białka w sposób całkowicie losowy, a więc nie niosący żadnej informacji.

Po trzecie wreszcie, biorąc pod uwagę złożoność białek, do ich analizy nie wystarczą tabele z przykładami fragmentacji (takie tabele wtłacza się do głów studentom chemii. Zawierają one zresztą nie tylko informacje o fragmentacjach w spektrometrii mas, ale także mnóstwo informacji dotyczących charakterystycznych cech widm w innych rodzajach spektroskopii). Do analizy białek niezbędne były olbrzymie bazy danych oraz potężne komputery, będące w stanie te bazy przeszukiwać i na ich podstawie analizować dane. Mówię potężne – w latach 80., dzisiaj wystarczy mały laptop z dostępem do sieci.

Tak więc badacze zajmujący się spektrometrią masową mieli kilka orzechów do zgryzienia. I jak powiedziałem na początku, połowa lat 80. przyniosła objawienie. Najpierw John Fenn zaproponował interfejs pomiędzy chromatografią cieczową a spektrometrią mas, źródło jonów, które dość zasadnie zostało nazwane electrosprayem (lub po polsku elektrorozpylaniem, chociaż nie jest to powszechnie stosowana nazwa) . Trzy lata później w odstępie zaledwie kilku miesięcy ukazały się dwie przełomowe prace, które zaowocowały rozwojem innej metody jonizacji – wspomaganej matrycą laserowej desorpcji/jonizacji (MALDI). Pierwsza praca autorstwa Tanaki przyniosła mu Nobla z chemii w 2002 roku, którego dzielił m.in. z Johnem Fennem. Także jednak druga z prac była olbrzymim przełomem dla proteomiki, a  jej autorzy Franz Hillenkmp i Michael Karas ukuli nazwę MALDI.

Jak dokładnie jonizowane są peptydy i białka tymi metodami dowiecie się jednak dopiero z następnego odcinka.

Spektrometria mas, red. Piotr Suder, Jerzy Silberring; Wydawnictwo UJ; Kraków 2006; ISBN 83-233-2151-5

Mann M, Hendrickson RC, & Pandey A (2001). Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry. Annual review of biochemistry, 70, 437-73 PMID: 11395414

Przeczytaj pierwszą część serii Analityczny kamień milowy.

9 Comments

    1. W kryminalistyce (polecam obejrzeć kilka odcinków CSI – wystarczą ze dwa albo trzy, żeby zobaczyć gdzie stosowany jest spektrometr masowy). W analizach środowiskowych – np. określanie czystości wody itp. W szpitalach do analizy próbek pochodzących od pacjentów. Do analizy szczelności systemów próżniowych (pompuje się do środka hel, a następnie sprawdza przenośnym spektrometrem wszystkie złącza na obecność wyciekającego gazu). Do analizy jakości produktów – leków, ale także znacznie bardziej prozaicznie w przemyśle spożywczym. W armii przenośne spektrometry służą do wykrywania broni chemicznej. Takie były wykorzystywane we wczesnej fazie wojny w Iraku. Z tej samej branży – na lotniskach wykorzystuje się spektrometry masowe do poszukiwania nielegalnych substancji, zwłaszcza wybuchowych. Mi tak kiedyś laptopa w Niemczech sprawdzono – miła pani w poważnym mundurze przejechała po klawiaturze wacikiem, wrzuciła go do wielkiej puszki, a po kilku minutach oświadczyła, że jednak nie jestem ani terrorystą, ani przemytnikiem.

      I tak dalej, i tym podobne.

      Lubię

    1. Tak, jak napisałem powyżej, znając masę związku można go często zidentyfikować, określić, jak jest zbudowany, jaki jest skład pierwiastkowy substancji itd. Często stosuje się spektrometrię mas w połączeniu z jakąś metodą rozdziału – np. z GC albo, zwłaszcza w proteomice, z LC (odpowiednio chromatografia gazowa i cieczowa). W takim połączeniu można też ustalić skład mieszanin różnych związków.

      To samo wykorzystuje się do analizy białek – ponieważ wiemy, ile ważą poszczególne aminokwasy możemy na podstawie masy peptydu wywnioskować (często z pomocą różnych tricków, ale jednak), jaki jest jego skład aminokwasowy, a nawet sekwencja – czyli możemy powiedzieć wprost, co to za peptyd. Więcej o tym już niedługo.

      Lubię

Skomentuj

Wprowadź swoje dane lub kliknij jedną z tych ikon, aby się zalogować:

Logo WordPress.com

Komentujesz korzystając z konta WordPress.com. Log Out / Zmień )

Zdjęcie z Twittera

Komentujesz korzystając z konta Twitter. Log Out / Zmień )

Facebook photo

Komentujesz korzystając z konta Facebook. Log Out / Zmień )

Google+ photo

Komentujesz korzystając z konta Google+. Log Out / Zmień )

Connecting to %s