Analityczny kamień milowy, cz.3.

ResearchBlogging.org

Karboksypeptydaza A – białka wykorzystane przez Koichi Tanakę w jego przełomowej pracy/ za: http://www.wikipedia.org (dom. publ.)

Skoro więc spektrometria masowa była tak niegościnną techniką do badań białek, nie można nie zadać pytania, jak to się stało, że obecnie nie da się w zasadzie wyobrazić badań białek bez użycia, na jakimś badań etapie, spektrometrii masowej. Jak już wspomniałem ostatnio, odpowiedzią były dwie nowe metody jonizacji: ESI (elektrosprej) oraz MALDI. Metody te nazywa się zresztą miękkimi właśnie ze wzlgędu na to, jak delikatnie obchodzą się one z biologicznymi makrocząsteczkami.

Dzisiaj więc będzie trochę technicznie: o tym, jak działa MALDI oraz jakie są wady i zalety tej metody (ważne w kontekście zbliżającego się zwieńczenia tej miniserii; zapraszam też wkrótce na wpis o ESI, a potem już powinno być z górki…). Post jest długi i niestety może być nieco przyciężki – znudzonym lub nie aż tak zainteresowanym polecam przeskoczyć od razu do wad i zalet ;)

Zacznijmy więc od MALDI – wspomaganej matrycą metody desorpcji/jonizacji. W ogólności metoda ta to dokładnie to, co mamy na etykiecie. Próbkę zawierającą nasze białko mieszamy z matrycą (co to – już za moment), umieszczamy na metalowej płytce, a następnie strzelamy w nią laserem, w efekcie czego zjonizowane cząteczki białka ulegają desorpcji z powierzchni tej płytki i odlatują do analizatora.

Jeśli przyjmiemy (dość zasadnie), że jonizacja jest metodą wzbudzenia białka, to widać od razu, jaka jest rola lasera – dostarcza on energii niezbędnej do tego wzbudzenia. Trzeba jednak powiedzieć dwie rzeczy: po pierwsze, jedną z definiujących charakterystyk laserów jest to, że produkują one światło o ściśle określonej długości fali; a po drugie, aby wzbudzić cząsteczkę czegokolwiek, należy jej dostarczyć energii odpowiadającej dokładnie (lub niemal dokładnie) różnicy jej poziomów energetycznych. Jednak różnice poziomów energetycznych są oczywiście różne w różnych cząsteczkach! Wiedząc to, należy zadać pytanie: jak to możliwe, że laser, który zawsze wysyła fotony o tej samej energii, może wzbudzić całą gamę różnorodnych cząsteczek – ponieważ w istocie nie ma teoretycznie limitu peptydów, białek, czy cukrów, które mogą być wzbudzone tą metodą (limity oczywiście są, ale wynikają z czego innego).

Kwas sinapinowy – podstawowa matryca w analizie białek metodą MALDI /za: http://www.wikipedia.org (dom. publ.)

Odpowiedź zawarta jest oczywiście w nazwie metody – odpowiedzią jest matryca. Jako matryce w MALDI stosuje się różne małe cząsteczki organiczne, które ulegają wzbudzeniu (jonizacji) przy energii lasera, a następnie przekazują część tego ładunku cząsteczkom białka, z którym są zmieszane, chroniąc je jednocześnie przed niszczącym wpływem światła laserowego. W tym procesie najczęściej dochodzi do przyłączenia do białka protonów (H+) lub małych kationów, np. sodu (Na+) lub potasu (K+, te dwa jony są obecne w większości buforów używanych do przygotowania próbek, stąd ich najpowszechniejsze występowanie). Powstają w ten sposób cząsteczki nazywane jonami kwazimolekularnymi oznaczanymi jako [M+H]+, gdzie M to masa białka, H to wodór, gdy ładunek pochodzi od innych kationów w nazwie oczywiście podstawia się wzór chemiczny kationu – sodu, potasu, czy czegokolwiek innego, + na końcu oznacza ładunek, jakim obdarzone jest to cząsteczkowe indywiduum. Czasem może dochodzić też do oderwania protonów i wówczas analogicznie jony kwazi-molekularne oznacza się, analogicznie, jako [M-H]. Jeśli zaś dojdzie do przyłączenia kilku protonów, to użyjemy oznaczenia [M+nH]n+, gdzie n to ilość przyłączonych protonów.

Rozwodzę się nad tą notację z dość istotnego powodu: jak pamiętacie, sygnałem mierzonym w spektrometrii mas jest stosunek masy do ładunku. Świadomość tego, że pik na widmie może pochodzić od białka z pojedynczym ładunkiem pochodzącym od protonu, albo innego kationu, albo od białka z wieloma ładunkami, ma zasadnicze znaczenie dla interpretacji tego widma. Aby lepiej to zrozumieć, spójrzmy na przykład: prosty standardowy peptyd, bradykininę.

Bradykinina ma masą cząsteczkową 1060.21 Da (Da, czyli Daltony to jednostki masy atomowej, u). Wyobraźmy więc sobie, że w trakcie jonizacji to cząsteczki bradykininy przyłączony zostanie jeden proton. Pik, które zaobserwujemy pojawi się na widmie w miejscu odpowiadającym stosunkowi masy do ładunku (m/z) wynoszącym 1061.21. Jeśli do bradykininy przyłączy się sód, to pik pojawi się przy m/z = 1083.21 (około oczywiście; masa cząsteczkowa sodu to ok 23 Da). Pierwsza zatem wskazówka do interpretacji widma: jeśli na widmie pojawią się dwa piki, oddalone od siebie o 22, jest duża szansa na to, że pochodzą one od tego samego peptydu/białka, do którego przyłączył się albo proton albo kation sodu.

Rozkład izotopowy peptydu masie 859,5 Da. /za: http://www.wikipedia.org; Mkotl (GNU GPL 3.0) ©2005

Innym zjawiskiem obserwowanym w spektrometrii mas jest tak zwany rozkład izotopowy. Ponieważ każdy, a przynajmniej znakomita większość pierwiastków na Ziemi występuje w postaci kilku izotopów, zdarzyć się może, że cząsteczka białka będzie zawierać pojedyncze atomy cięższych izotopów – np. węgla 13, tlenu 17, azotu 15. Nie jest to nic nadzwyczajnego – dla przykładu, węgiel 13 stanowi ok 1% węgla występującego na Ziemi, co oznacza, że jeden na sto atomów węgla jest cięższy. A w białkach węgla jest mnóstwo… Wynikiem tego jest właśnie charakterystyczny wygląd pików, nazywany rozkładem izotopowym – za pikiem najbardziej intenstywnym, który odpowiada wszystkim cząsteczkom białka posiadającym najbardziej powszechne izotopy, pojawiają się w równych odstępach dalsze piki odpowiadające cząsteczkom tego samego białka posiadającym jeden atom cięższego izotopu – czy to węgla, czy innego pierwiastka, a następnie dwa atomy cięższych izotopów, trzy itd.

Wracając więc do bradykininy – jeśli widzimy pik przy m/z = 1061.23, a następny mniejszy pik izotopowy przy 1062.23, a potem 1063.23, możemy śmiało przyjąć, że jest to bradykinina z jednym dodatkowym protonem. Ale wyobraźmy sobie, że znaleźliśmy pik przy m/z = 531.11, a następne piki izotopowe następują nie po jednej, ale po pół jednostce, czyli przy m/z = 531.61, a potem 532.11 itd. Wówczas wywnioskować możemy, że jest to bradykinina z dwoma przyłączonymi protonami (bo 1060 + 2 = 1062, a 1062/2 = 531). Jak więc widać, widma masowe dostarczają nam mnóstwo informacji pozwalających określić, jaką dokładnie masę mają obserwowane przez nas cząsteczki.

Nie chcę nikogo tutaj zwodzić, więc od razu wyjaśnię – określnie masy nie daje nam jeszcze identyfikacji. Bo łatwo przecież wyobrazić sobie dwa peptydy, które będą miały taki sam skład aminokwasowy, a więc i identyczną masę, ale różną aminokwasów sekwencję, a co za tym idzie i strukturę. W przypadku peptydów sprawa jest prostsza – wykorzystuje się spektrometry, które umożliwiają kontrolowane rozbijanie wiązań peptydowych i dzięki temu określić można sekwencję aminokwasów w peptydach. Znacznie trudniejsze jest to w przypadku białek. Tu z pomocą przychodzi technika nazywana z angielska peptide mass fingerprinting (PMF; przykro mi, ale nie znam polskiej nazwy). Metoda ta opiera się na założeniu, że znamy dzisiaj większość białek, a ich sekwencje zawarte są w olbrzymich, komputerowych bazach danych. Potrafimy też powiedzieć, na jakie peptydy rozbiciu ulegnie białko strawione określonym enzymem (większość enzymów proteolitycznych tnie wiązania tylko między ściśle określonymi aminokwasami). W procedurze PMF białko trawi się np. trypsyną, a następnie identyfikuje tak wiele peptydów, jak to tylko możliwe. Zestaw peptydów jest dla białka jak odcisk palca – garść zidentyfikowanych peptydów porównuje się z bazą danych i przy odrobinie szczęście można białko zidentyfikować z dość dużą pewnością. Oczywiście im więcej peptydów pochodzących z jednego białka możemy zidentyfikować – tym lepiej, bo mniejsza jest szansa znalezienia dwóch białek, które zawierać będą takie same peptydy, a więc mniejsza szansa na błędną identyfikację. PMF stosować można oczywiście zarówno w przypadku MALDI, jak i ESI – jest to obecnie standardowa metoda identyfikacji białek.

No ale zboczyłem z tym PMF (chociaż dobrze, może przynajmniej łatwiej będzie teraz zrozumieć, jak się identyfikuje białka znając tylko masę) i przynudziłem w tym i tak długim wpisie. Więc na koniec krótko o wadach i zaletach MALDI.

Na początek zalety, żeby nie było, że jestem zawsze na nie:

  • po pierwsze, MALDI jest bardzo łatwe w użyciu. Sam robiłem magisterkę na instrumencie firmy Waters, które było najbardziej idiotoodpornym urządzeniem wyprodukowanym przez człowieka;
  • po trzecie, odznacza się niezwykłą czułością – da się nią wykryć attomole cząsteczek (czyli wystarczą dziesiątki tysięcy molekuł w próbce; wiem, że nie brzmi to przekonywująco, ale wierzcie mi, w skali mikro 10 tysięcy cząsteczek to nic);
  • po czwarte – duża przepustowość i łatwość automatyzacji.

Z co ważniejszych wad to:

  • znakomita metoda do analizy peptydów. Wciąż jednak mało użyteczna do badania całych białek;
  • bardzo, bardzo wrażliwa na zanieczyszczenia. Przed analizą próbkę często oczyszcza się np. z jonów sodu i potasu – ponieważ powstawanie obok jonów [M+H]+ jonów [M+Na]+ czy [M+K]+ po pierwsze zmniejsza intensywność pików (bo ta sama ilość białka czy peptydu zostaje rozdzielona pomiędzy kilka pików); a po drugie widmo z dużą ilością pików jest oczywiście znacznie trudniejsze do interpretacji;

I to by było na tyle. Następnym razem słów kilka (może nie aż tyle, co dzisiaj. Chociaż kto wie…) o ESI. A potem powinniśmy już przejść do nieco świeższej, niedawno publikowanej nauki.

Zapraszam też do zajrzenia do części pierwszej oraz drugiej tej miniserii.

Tanaka, K., Waki, H., Ido, Y., Akita, S., Yoshida, Y., Yoshida, T., & Matsuo, T. (1988). Protein and polymer analyses up tom/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2 (8), 151-153 DOI: 10.1002/rcm.1290020802

Karas, M., & Hillenkamp, F. (1988). Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons Analytical Chemistry, 60 (20), 2299-2301 DOI: 10.1021/ac00171a028

Advertisements

6 Comments

  1. Kurcze, kiedyś trochę o tym czytałam, ale dopiero dzięki Tobie mogę sobie nabudowywać bardziej szczegółowe informacje na porządnym rusztowaniu! Gratuluję stylu, lekkości i przejrzystości wypowiedzi, przy czym szczególnie cenna jest Twoja umiejętność opisania tylko najistotniejszych rzeczy :)

    Lubię to

Skomentuj

Wprowadź swoje dane lub kliknij jedną z tych ikon, aby się zalogować:

Logo WordPress.com

Komentujesz korzystając z konta WordPress.com. Log Out / Zmień )

Zdjęcie z Twittera

Komentujesz korzystając z konta Twitter. Log Out / Zmień )

Facebook photo

Komentujesz korzystając z konta Facebook. Log Out / Zmień )

Google+ photo

Komentujesz korzystając z konta Google+. Log Out / Zmień )

Connecting to %s