Analityczny kamień milowy, cz.4.

Igła (dysza) w instrumencie nanoESI/ za: www.wikipedia.org; Mkotl (GNU GPL 3.0) ©2005

ResearchBlogging.org

Igła (dysza) w instrumencie nanoESI/ za: http://www.wikipedia.org; Mkotl (GNU GPL 3.0) ©2005

Dzisiaj będzie króciutko (chyba) o tym, co to jest i jak działa elektrorozpylanie w spektrometrii masowej oraz jakie są zalety i wady tej metody. Chyba że mi się znowu dygresja jakaś przytrafi, to wtedy może być nieco dłużej.

Elektrorozpylanieelectrospray (ESI) – zostało jako metoda jonizacji makromolekuł opisane przez Johna Fenna (wspomniany już Nobel z chemii w 2002 roku) w połowie lat 80. ESI jest drugą miękką metodą jonizacji – czyli, jak pisałem poprzednio, metodą, która nie powoduje rozpadu białek na drobne.

W metodzie ESI białko doprowadzone jest do jonizatora w postaci roztworu w mieszaninie wody i jakiegoś lotnego rozpuszczalnika (najczęściej acetonitrylu lub metanolu). To jedna z pierwszych olbrzymich zalet, o której jednak później. Roztwór ten wprowadzany jest przez rurkę – kapilarę – do maleńkiej dyszy, z której wystrzeliwywany jest do komory jonizatora w postaci aerozolu. Cała gama trików została wymyślona tylko w jednym celu – aby polepszyć proces nebulizacji (wytwarzania aerozolu). Można więc do roztworu dodać substancje zwiększające jego konduktywność (przewodność) – najczęstszym przykładem tutaj jest kwas octowy. Można też nebulizację usprawnić przez wspomaganie rozpylania strumieniem azotu płynącym dookoła końcówki dyszy.

Ale koniec końców ważne jest jedno – w komorze jonizatora znajdują się liczne mikroskopijne krople roztworu zawierające białka. W następnym etapie jonizacji krople te są przenoszone do komory, w której panują warunki próżniowe. W tych warunkach następuje intensywne odparowanie rozpuszczalników. W procesie tym dochodzi do akumulacji ładunku na powierzchni zmniejszającej się kropli. W pewnym zaś momencie następuje zjawisko nazywane rozszczepieniem coulombowskim –  pod wpływem oddziaływania elektrostatycznego ładunków na powierzchni kropla rozpada na się na mniejsze kropelki. Trwa to do momentu, gdy jedyne, co pozostaje z pierwotnej kropli, to białko obdarzone wielokrotnym ładunkiem elektrycznym.

Jest to jedna z bardzo charakterystycznych cech jonizacji ESI: w przeciwieństwie do MALDI, która daje białka obdarzone w najlepszym razie dwoma lub trzema ładunkami, electrospray produkuje białka niosące 20+ ładunków. Ma to olbrzymie konsekwencje dla analizy jonów, a potem widm. Weźmy na przykład białko o masie 1 miliona Daltonów (1 MDa). W spektrometrze stosującym MALDI takie białko dałoby sygnał przy m/z=1000000, być może m/z=500000. W instrumencie stosującym ESI sygnał pojawi się przy m/z=4000-5000. Oznacza to, że do dalszej części eksperymentu można użyć analizatora o znacznie mniejszym zakresie mas. Nad analizatorami się tutaj nie rozwodziłem (i nie zamierzam), ale dość powiedzieć, że jest ich całe mnóstwo i każdy jeden ma pewne ograniczenia – a ograniczeniem większości z nich jest właśnie maksymalny sygnał m/z jaki można zmierzyć. ESI jest więc niezwykle wygodne, bo produkuje jony, które można analizować wieloma różnymi analizatorami, korzystając z dobrodziejstw każdego z nich.

Z drugiej jednak strony, ze względu na ten wielokrotny ładunek, widma masowe są nieporównywalnie bardziej skomplikowane niż widma pochodzące z instrumentów używających MALDI. Coś za coś, jak widać.

Wreszcie niech wrócę do tematu wprowadzania próbki do jonizatora – ponieważ próbkę dostarcza się w sposób ciągły, naturalnym wydaje się połączenie takiego spektrometru z jakąś metodą oczyszczania czy rozdziału próbki – wybór pada więc z łatwością na metody kolumnowe, albo powszechnie stosowaną chromatografię cieczową albo elektroforezę kapilarną. Dzięki temu wprowadzany do jonizatora analit jest znacznie lepiej oczyszczony/rozdzielony, co ułatwia oczywiście analizę (nie muszę chyba tłumaczyć, że lepiej jest mieć do czynienia z widmem zawierającym sygnał jednego białka, niż dwóch, pięciu, czy dziesięciu). Ponadto ESI jest z natury rzeczy znacznie bardziej niż MALDI odporne na zanieczyszczenia w roztworze.

Podsumujmy więc. Zalety ESI:

  • wielokrotna jonizacja pozwala na dużą elastyczność w wyborze analizatora;
  • możliwość połączeń on-line z różnymi metodami rozdziału (LC/CE);
  • jest to najbardziej miękka z istniejących metod jonizacji;
  • znakomita czułość.

Wady?

  • niezbyt pomocna do analiza mieszanin;
  • skomplikowane widma;
  • mała dokładność;
  • może nie do końca związane z metodą, ale też bolączka każdego właściciela ESI – czyszczenie zanieczyszonego instrumentu to syzyfowa praca.

Już w następnej – prawdopodobnie ostatniej części – odpowiemy na pytanie, co jest najprawdopodobniej jednym z największym wyzwań stojących przed współczesną spektrometrią masową w analizie próbek biologicznych. Tymczasem, jak zwykle już, polecam zajrzeć do części pierwszej, drugiej i trzeciej tej serii.

Fenn, J., Mann, M., Meng, C., Wong, S., & Whitehouse, C. (1989). Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules Science, 246 (4926), 64-71 DOI: 10.1126/science.2675315

4 Comments

  1. Naprawdę fajne i przystępne repetytorium :) O MALDI jakoś tak więcej się mówi i tą metodę kojarzę lepiej, natomiast w ESI nigdy się nie wgłębiałam. poparłbyś może notkę jakimś obrazem widma?
    Proteomika jest jakaś taka… za bardzo skomplikowana jak dla mnie, nie to co genomika i PCRy!

    Miłego wypoczynku i do przeczytania za jakiś czas!

    Lubię

Skomentuj

Wprowadź swoje dane lub kliknij jedną z tych ikon, aby się zalogować:

Logo WordPress.com

Komentujesz korzystając z konta WordPress.com. Log Out / Zmień )

Zdjęcie z Twittera

Komentujesz korzystając z konta Twitter. Log Out / Zmień )

Facebook photo

Komentujesz korzystając z konta Facebook. Log Out / Zmień )

Google+ photo

Komentujesz korzystając z konta Google+. Log Out / Zmień )

Connecting to %s