Najwyższa więc pora rzucić okiem na nowinki techniczne, których zadaniem jest sprowadzenie spektrometrii masowej na nowe tory – te zbudowane przez coraz szybciej rozwijające się technologie mikroanalityczne.
Wyłuszczyłem wady i zalety zarówno MALDI jak i elektrorozpylania. Byłbym jednak kłamcą, gdybym twierdził, że od połowy lat 80. nic się w tej dziedzinie nie zmieniło. Metod jonizacji różnego rodzaju powstaje coraz więcej. W zakresie jednak jonizacji białek są to najczęściej wariacje i kombinacje tych dwóch metod.
Wróćmy teraz trochę do proteomiki. Cóż bowiem z tego, że możemy zidentyfikować białka? No może i możemy, ale pytanie, po co nam to. Ano po to na przykład, że dzisiaj wiemy i rozumiemy już bardzo wiele na temat tego, jak funkcjonuje nasz organizm; jaka jest etiologia wielu chorób na poziomie molekularnym; jak odróżnić – właśnie na podstawie obecności pewnych białek lub zmian ich ilości – stan patologiczny od stanu normalnego.
Z jednej więc strony mamy proteomikę, która niesie ogrom informacji nie tylko podstawowych o białkach, ale także użytecznych z punktu widzenia normalnego zjadzacza chleba.
Z drugiej strony zaś mamy olbrzymi rozwój technologii mikroanalitycznych – tej dziedziny tzw. lab-on-a-chip, która pozwala na analizę bardzo niewielkich próbek.
Te dwa koncepty – nauki, która mówi nam o tym, jak skład białkowy komórek definiuje ich stan zdrowotny, oraz metodyki, która pozwala na analizę bardzo niewielkich ilości materiału biologicznego (lab-on-a-chip, czy też mikrofluidyka, ma znacznie więcej zalet, ale ta jedna jest tu bardzo istotna) – te dwa koncepty rewolucjonizują powoli analitykę medyczną. I nawet jeśli nie ma jeszcze (zbyt wielu) klinicznych zastosowań, to parcie na szkło tych idei jest ogromne, więc należy oczekiwać ich zaistnienia w laboratoriach klinicznych już w niedalekiej przyszłości.
Problemy z jakimi porykają się jednak analitycy stosujący spektrometrie masową, mimo tego ogromnego postępu, są niemal niezmiennie te same.
Niezależnie od tego, jaką metodę jonizacji próbki wybierzemy, zawsze nadziewamy się na problem takiego czy innego jej zanieczyszczenia. Żeby więc zanalizować cokolwiek trzeba materiał pobrany od pacjenta, czy jest to krew, mocz (mocz akurat jest bardzo user-friendly), sperma czy płyn mózgowo-rdzeniowy, spreparować odpowiednio. Przefiltrować, rozcieńczyć, oczyścić – innymi słowy pozbyć się z niej nieinteresującego badziewia. Bo jeśli na przykład chcemy zidentyfikować i oszacować ilość jakiegoś białka, które znajduje się w osoczu krwi, to nie będziemy przecież zapychać spektrometru znacznie większymi komórkami krwi. Jeśli chcemy pomierzyć ilość jakiegoś białka w ekstrakcie (brzydkie słowo, powiedzmy – biopsji z) dajmy na to wątroby, to po zmieleniu komórek na pierze postaramy się usunąć na przykład tony błon komórkowych, które nie tylko nie są nam potrzebne, ale mogą wręcz instrument uszkodzić.
I tak dalej, i tym podobne.
Jakże więc proces analizy próbki od pacjenta przyspieszyć? Oraz – czy da się wykonać analizę bez pobierania od pacjenta pinty krwi? Czy można tylko z kropli?
Że można z kropli analizę zrobić w ogólności, to wiadomo od dawna (vide wystąpienie George’a Whitesidesa w Bostonie, które tu kiedyś wrzuciłem). Ale co, jeśli chcemy wykonać pomiar spektrometrem masowym? Sprawa już nie taka prosta. Tu z pomocą może przyjść technika opisana na początku tego roku przez grupę chińsko-amerykańską. Metoda, która nie ma chyba jeszcze polskiej nazwy, niech więc będę jej (nazwy znaczy) tatą, nazywa się sprejem papierowym.
W metodzie tej próbkę – ok. 10μL – nanosi się na maleńki kawałek papieru, do którego przykładane wysokie napięcie. Jak to po raz pierwszy przeczytałem, to aż mi się pośladki z podniecenia zwarły. Łatwo sobie bowiem wyobrazić zastosowanie tego… gdziekolwiek. Papier w końcu jest produktem ogólnie dostępnym. Można więc zastosować papierową chusteczkę do wytarcia krwi, a następnie poddać ją analizie. Autorzy pracy pokazali, że tę opracowaną przez nich metodę można zastosować nie tylko do wykrywania i analizy białek zawartych w próbce, ale także do analizy małych substancji organicznych (leków? narkotyków?). W połączeniu zaś z miniaturowymi spektrometrami masowymi jonizacja sprejem papierowym może być odpowiedzią na potrzeby rynku analizy natychmiastowej – czyli nie czekającej na dostarczenie próbki do labu, przygotowanie jej i zanalizowanie.
Także proszę Państwa, niniejszym ogłaszam: rozpoczęła się właśnie papierowa rewolucja…
Jest więc sprej papierowy sposobem na obejście problemu zanieczyszczonej (czyt. niejednorodnej) biologicznej próbki – zamiast próbować wszystko od białek oddzielić przed wpakowaniem ich do spektrometru, po prostu oddziela się same białka.
Drugą wariacją na temat elektrorozpylania (tutaj połączonego z MALDI) jest metoda nebulizacji powierzchniowymi falami akustycznymi. Metoda ta jest jedną z propozycji rozwiązania proteomiczno-mikrofluidycznego konundrum: jak maleńką ilość próbki preparowanej w mikrocieczowym czipie przenieść sprytnie i bez strat do spektrometru. Do tej pory najczęstszym rozwiązaniem były różne modyfikacje metody nanorozpylania – podobnej bardzo do elektrorozpylania, tylko – w uproszczeniu – z mniejszymi tubkami doprowadzającymi próbkę, mniejszą dyszą i ogólnie wszystkim mniejszym (bo rozmiar przecież ma znaczenie). Połączenie więc nanospreja z mikroczipami było dość naturalne, ale okazało się nie do końca udanym mariażem produkującym urządzenia hybrydowe, w których kanaliki czipu łączone były z kapilarami prowadzącymi do jonizatora. Sam ten interfejs jest nieszczególnym rozwiązaniem, jeśli więc można go ominąć – tym lepiej!
Grupa Jona Coopera z Uniwersytetu w Glasgow opisała więc zaledwie kilka miesięcy temu urządzenie, w którym zastosowali tę nebulizację powierzchniowymi falami akustycznymi (SAWN, z ang. surface acoustic wave nebulization). Metoda ta łączy pewne zalety MALDI – ponieważ jonizacja nie jest ciągła, ale odbywa się pulsacyjnie, można wielokrotnie badać jedną próbkę, aż do wyczerpania analitu – oraz ESI – dając wielokrotnie naładowane jony molekularne (o tym, dlaczego jest to zaleta, pisałem wcześniej).
W skrócie więc: w czipie wbudowane są przetworniki międzypalczaste (czyż nie jest to urocza nazwa?), wykorzystujące zjawisko piezoelektryczne do generowania powierzchniowych fal akustycznych. Fale te zaś na próbkę umieszczoną na powierzchni czipu (fale generowane są od spodu) działają jak fala uderzeniowa, wyrzucając ją w powietrze (figuratywnie mówiąc), w kierunku analizatora. I w sumie tyle. Albo aż tyle. Zależy od punktu widzenia i siedzenia (z punktu siedzenia operatora spektrometru na ten przykład to raczej aż aniżeli w sumie).
Jon Cooper ze współpracownikami przetestowali system na peptydach; sprawdzili nie tylko skuteczność metody (oczywiście), ale i jej wydajność w zależności np. od tego, jak potężne były generowane powierzchniowe fale akustyczne. Pokazali też, że można urządzenia oparte na SAWN stosować do tandemowej spektrometrii mas – o której chyba nie pisałem, więc musicie mi uwierzyć na słowo, że to jest świetna wiadomość dla wszystkich amatorów masówki.
I tym radosnym akcentem kończę serię proteomiczną. Jeśli chciałbym, żebyście coś z niej wynieśli, to świadomość, że analityka biologiczna/medyczna wchodzi pod strzechy w postaci zminiaturyzowanych systemów, a nawet tak zaawansowana technicznie metoda jak spektrometria masowa, wkrótce znajdzie sposób, aby się Wam wpakować do pokoju gościnnego. No i jeśli chcecie wiedzieć, co w tej dziedzinie jest właśnie bardzo trendy, edgy i jazzy, to tu podpowiedź: szukajcie na dole (i pardon za tę niezgrabną referencję do Feynmana).
I jak zwykle tych, którzy dopiero teraz zauważyli wątek, odsyłam do części pierwszej, drugiej, trzeciej i czwartej tej serii.
Liu, J., Wang, H., Manicke, N., Lin, J., Cooks, R., & Ouyang, Z. (2010). Development, Characterization, and Application of Paper Spray Ionization Analytical Chemistry, 82 (6), 2463-2471 DOI: 10.1021/ac902854g
Heron, S., Wilson, R., Shaffer, S., Goodlett, D., & Cooper, J. (2010). Surface Acoustic Wave Nebulization of Peptides As a Microfluidic Interface for Mass Spectrometry Analytical Chemistry, 82 (10), 3985-3989 DOI: 10.1021/ac100372c
nic prostszego 
Wszystko zależy do tego co i po co się modeluje ;)
PolubieniePolubienie
Bardzo ciekawy, 5 częściowy art ;-) Ciekawi mnie przyszłość analizy skomplikowanych białek w połączeniu z modelowaniem molekularnym. Być może kiedyś dostaniemy sprzęt, który po zanalizowaniu próbki wyrzuci cały model przestrzenny interesującego nas białka na monitorze. I to w czasie mniejszym niż rok ;-) Wówczas analiza wszelkich konformacji, miejsc fosforylacji, modyfikacji będzie kaszką z mleczkiem.
Wiesz może czy coś takiego jest w drodze ? Z zajęć modelowania molekularnego wyniosłem tylko to, że zdałem sobie sprawę, że jeszcze kawał drogi do takiego „zwiewnego” i oszczędzającego czas sprzętu. Póki co modelowanie molekularne wydaje mi się odrobinę… „toporne” :)
PolubieniePolubienie
Tak, jak już zauważył Marcin – to jak skomplikowane jest modelowanie, zależy od tego, co się modeluje. Jeśli zaś chodzi o białka i analizę masówką, to jednak szczerze wątpię, żeby taka hybrydowa technika analizująco-modelująca była prędko dostępna. Zresztą nie do końca widzę jej sens, bo to są dwie zupełnie różne aplikacje, dwa zupełnie różne rodzaje badań. Modelowanie jest bowiem bardziej istotne dla badań strukturalnych, podczas gdy takie badania za pomocą spektrometrii masowej są niezwykle trudne (nie mówię, że niemożliwe, ale nie jest to klasyczne zastosowanie tej technologii).
PolubieniePolubienie