Krystalografia bez kryształu

Gdy w grudniu wspominałem o tym, co według magazynu Science było odkryciem roku 2012 (anticlimax – bozon Higgsa), na liście odkryć, które zajęły drugie miejsce ex aequo znalazło się opisanie struktury krystalicznej białka za pomocą ksazerów: laserów działających w zakresie promieniowania X.

Lasery (i mam cichą nadzieję, że czytający to fizycy wybaczą mi uproszczenia i małe przekłamania) to  rodzaj źródeł światła charakteryzujący się kilkoma szczególnymi właściwościami emitowanego promieniowania. Taka wiązka jest więc po pierwsze spójna – tzn. że wszystkie fotony zawarte w wiązce są w tej samej fazie. Innymi słowy ich emisja musi być bardzo precyzyjnie zsynchronizowana. Po drugie promieniowanie lasera jest zbieżne; to oznacza, że przekrój wiązki pozostaje taki sam nawet bardzo daleko od źródła. Wreszcie – promieniowanie laserowe ma jedną charakterystyczną dla danego lasera częstotliwość.

Aby zbudować laser działający dla określonej długości fali, trzeba po prostu znaleźć substancję z określonymi właściwościami spektralnymi. Łatwiej jednak powiedzieć, niż zrobić: takich związków nie potrafimy w zasadzie zaprojektować, a ich poszukiwania sprowadzają się do syntezy kolejnych nowych materiałów i sprawdzania, czy się do czegokolwiek nadają. No i tak się składa, że pewnego typu lasery stworzyć było łatwiej (a bo materiał już był dostępny, trzeba tylko było rozpoznać jego potencjał; a bo to pewne właściwości są bardziej powszechne itd., itp.). I potrafimy już wyprodukować wiele laserów, które emitują w zakresie światła widzialnego (np. laser neodymowy, Nd:YAG, 532 nm; laser kryptonowy, jeden z najstarszych historycznie laserów: laser helowo-neonowy), w zakresie światła podczerwonego (ponownie laser Nd:YAG, 946 nm; i laser helowo-neonowy; a także kilka innych laserów opartych na granacie itrowo-aluminiowym). Udało nam się także stworzyć gamę laserów produkujących promieniowanie w zakresie światła ultrafioletowego (tzw. lasery ekscymerowe).

Jeden zakres fal, który nam jednak do niedawna umykał, to promieniowanie X: promieniowanie elektromagnetyczne z zakresu od ok. 0.01 do 10 nm, energetycznie najpotężniejsze (fotony światła widzialnego niosą między 1 a 10 eV energii; twarde promieniowanie X to już 10 do 100 keV!). Powodów, dla których ten akurat zakres promieniowania jest dla nas interesujący – poza tym oczywiście, że jest jedynym jeszcze laserowo nie wyeksploatowanym – jest wiele. Na przełomie lat 70. i 80. XX w. rząd amerykański kontemplował pomysł zastosowania ksazerów – laserów działających w zakresie promieniowania X – w kosmicznej linii obrony Stanów Zjednoczonych przez zmasowanym atakiem rakietami dalekiego zasięgu (Project Excalibur). Pomysł ten jednak upadł (i całe szczęście!) na początku lat 90., gdy uznano, że ksazery są poza technologicznym zasięgiem.

Ksazery są znacznie jednak ciekawsze dla biologów i chemików: zakres fal odpowiada bowiem długościom wiązań w cząsteczkach, a także najmniejszym dystansom pomiędzy oddziałującymi molekułami. Promieniowanie X było oczywiście stosowane w krystalografii przez ostatnie ponad 100 lat. Jednak ksazery wniosłyby do takich badań nową jakość: ze spójnością i niesamowitą mocą wiązki promieniowania, które je charakteryzują, pozwoliłyby zwiększyć czułość badań krystalograficznych wielokrotnie. A, jak powie Wam każdy krystalochemik/fizyk, najbardziej karkołomną częścią takich badań jest uzyskanie jednorodnych kryształów wystarczająco dużych, aby dało się cokolwiek pomierzyć. Ksazery obiecują więc tutaj wiele.

ResearchBlogging.orgPonownie w naszym technologicznym zasięgu ksazery znalazły się kilka lat temu. W 2007 i 2010 roku w piśmie Nature Photonics pojawiły się dwie prace opisujące pierwsze ksazery na swobodnych elektronach (XFEL). Na początku 2011 Nature opublikowało wyniki badań wykorzystujących ten typ ksazerów do badań na nanokryształach białkowych. Zbadano w ten sposób strukturę krystalograficzną fotosystemu I, a rozmiary kryształów wahały się od 200 nm do 2 um. Jest to też jedna z pierwszych prac dyskutujących problem zniszczeń dokonywanych przez wysokoenergetyczne ksazery: aby zmierzyć próbkę, zanim ulegnie ona obliteracji przez ksazer, wykorzystano bardzo krótkie pulsy promieniowania – długości femtosekund – które były znacznie krótsze niż czas potrzebny do zniszczenia próbki.

Wreszcie wraz z początkiem 2012 roku w Nature ukazała się kolejna publikacja opisująca pierwszy ksazer atomowy, który pompowano (aby wymusić emisję światła; więcej o pompowaniu laserów tutaj) właśnie z pomocą XFEL; ksazer ten emitował promieniowanie o długości 1.46 nm. No i tutaj dochodzimy do pracy, którą Science nazwał niemal-odkryciem roku – opisania struktury krystalograficznej enzymu pełniącego kluczową rolę w patogenezie świdrowca Trypanosoma brucei, który wywołuje u zwierząt chorobę nagana.

Istnieją już leki przeciwko innym świdrowcom, których celem są podobne enzymy. Nie dało się jednak do tej pory opracować związku, który mógłby hamować rozwój T.brucei. Jednym z powodów jest to, że struktura tegoż enzymu, katepsyny B, w tym gatunku jest po prostu nieznana. Autorzy tej publikacji opracowali metodę, w której katepsyna B ulegała zwiększonej ekspresji, dzięki czemu tworzyła kryształy rozmiaru mikrometrów. Te kryształy były następne spuszczane swobodnie przez wiązkę lasera XFE – pomiar był z nich uzyskiwany tuż przed tym, gdy wiązka lasera całkowicie je niszczyła. Koniec końców jednak udało się uzyskać strukturę tego białka6.

Czyli wiemy już tyle: istnieją lasery działające w zakresie promieniowania X, dzięki czemu powinniśmy niesamowicie polepszyć czułość metod krystalograficznych. Zademonstrowano to już na przykładzie białek – i alleluja i chwała za to. Często w dyskusjach nad strukturami białek powracać będzie jednak jeden poważny problem: białka błonowe. Problem z białkami błonowymi polega na tym, że niezwykle ciężko (o ile w ogóle) się je krystalizuje. Ponieważ duży fragment każdego białka błonowego znajduje się, z definicji, w błonie komórkowej (zbudowanej z lipidowej dwuwarstwy), bardzo niekorzystne są jego właściwości chemiczne – ten błonowy fragment musi być hydrofobowy. Oznacza to, że gdy tylko „wyciągnie się” takie białko z błony (np. metodami chemicznymi), zacznie ono błyskawicznie ulegać niekontrolowanej agregacji dając i owszem zbitą masę – ale niestety nie jednolity kryształ. Najwygodniej byłoby oczywiście mierzyć taką strukturą z białkiem osadzonym w błonie albo innym tego rodzaju medium. Do tej pory jednak nie mieliśmy jednak oczywiście możliwości, aby mierzyć cokolwiek z czułością pojedynczych cząsteczek. Ksazery jednak zmieniły oblicze tego pola bitwy.

I doszliśmy po tym długim (chociaż mam nadzieję, że choć trochę ciekawym) wywodzie do głównego punktu programu: do pracy opublikowanej w zeszłym tygodniu w tygodniku Nature. Japońsko-fińska grupa badaczy postanowiła odnieść się do problemu krystalizacji. Jak wspomniałem wcześniej, krystalizacja substancji, której strukturę chcemy rozwiązać, jest jednym z najbardziej karkołomnych zadań w badaniach krystalograficznych. Autorzy tej pracy zadali jednak pytanie: a co, gdybyśmy wzięli szkielet krystaliczny i wykorzystali go jako macierz, w której zawieszone są cząsteczki, które chcemy zbadać?

Przykład związku unieruchomionego w kompleksowej krystalicznej gąbce. /Przedruk za zgodą Macmillan Publishers Ltd.: Inokuma et al., Nature 495, 461–466 ©2013
Przykład związku unieruchomionego w kompleksowej krystalicznej gąbce. /Przedruk za zgodą Macmillan Publishers Ltd.: Inokuma et al., Nature 495, 461–466 ©2013

W pracy wykorzystali porowate sieci metalowych związków kompleksowych, które działały jak „krystaliczne gąbki”. Pory w takiej sieci mają zdolność rozpoznawania innych cząsteczek i wiązania ich w ściśle określony – i co ważne, zawsze ten sam – sposób. Badacze opracowaną metodę zastosowali do zbadania struktury krystalicznej niezwykle rzadkiego naturalnego produktu dopiero niedawno po raz pierwszy wyizolowanego z morskiej gąbki Petrosia sp. – miyakosyny A (ang. miyakosine A – jak zwykle pozwoliłem sobie na dowolne spolszczenie; o ile mi wiadomo nie ma jeszcze oficjalnej polskiej nazwy tej cząsteczki). Miyakosyna A ma trzy centra chiralne i chociaż udało się ustalić, w jakiej konformacji (R czy S) są dwa z nich, trzecie centrum umykało do tej pory możliwościom technologicznym. Dzięki jednocząsteczkowej krystalografii z zastosowaniem ksazera udało się jednak ustalić konformację trzeciego centrum chiralnego.

W panelu a) struktura miyakosyny A z zaznaczonymi centrami chiralnymi. Nieznana była do tej pory konformacja węgla 14. W panelu B miyakosyna A uwięziona w porach klatratu - i wreszcie w panelu C określona dzięki nowej metodzie absolutna struktura miyakosyny A. /Przedruk za zgodą Macmillan Publishers Ltd.: Inokuma et al., Nature 495, 461–466 ©2013
W panelu a) struktura miyakosyny A z zaznaczonymi centrami chiralnymi. Nieznana była do tej pory konformacja węgla 14. W panelu B miyakosyna A uwięziona w porach klatratu – i wreszcie w panelu C określona dzięki nowej metodzie absolutna struktura miyakosyny A. /Przedruk za zgodą Macmillan Publishers Ltd.: Inokuma et al., Nature 495, 461–466 ©2013

Hip hip hura – czyli do nowonabytej czułości dodano wreszcie dodatkowy element pozwalający przygotować próbki, na których tę czułość możnaby testować; a być może także pozwalający badań próbki do tej pory dla nas nieosiągalne. Pozostaje nam tylko czekać na pierwsze struktury krystalograficzne kolejnych i kolejnych białek błonowych w konfiguracji nieskrytalizowanej, a więc być może najbliższej naturalnej. I nie żartuję tutaj, i nie przesadzę, jeśli powiem, że pierwsza struktura białka błonowego pozyskana z pojedynczej cząsteczki w konfiguracji naturalnej może być warta Nobla. Chociaż na sprawdzenie zasadności tego mojego typu będziecie pewnie musieli poczekać jeszcze kilka dobrych lat.

Przypisy:

1. Ackermann, W., Asova, G., Ayvazyan, V., Azima, A., Baboi, N., Bähr, J., Balandin, V., Beutner, B., Brandt, A., Bolzmann, A., et al. (2007). Operation of a free-electron laser from the extreme ultraviolet to the water window Nature Photonics, 1 (6), 336-342 DOI: 10.1038/nphoton.2007.76

2. Emma, P., Akre, R., Arthur, J., Bionta, R., Bostedt, C., Bozek, J., Brachmann, A., Bucksbaum, P., Coffee, R., Decker, F. et al.  (2010). First lasing and operation of an ångstrom-wavelength free-electron laser Nature Photonics, 4 (9), 641-647 DOI: 10.1038/nphoton.2010.176

3. Chapman, H., Fromme, P., Barty, A., White, T., Kirian, R., Aquila, A., Hunter, M., Schulz, J., DePonte, D., Weierstall, U. et al. (2011). Femtosecond X-ray protein nanocrystallography Nature, 470 (7332), 73-77 DOI: 10.1038/nature09750

4. Rohringer, N., Ryan, D., London, R., Purvis, M., Albert, F., Dunn, J., Bozek, J., Bostedt, C., Graf, A., Hill, R., Hau-Riege, S., & Rocca, J. (2012). Atomic inner-shell X-ray laser at 1.46 nanometres pumped by an X-ray free-electron laser Nature, 481 (7382), 488-491 DOI: 10.1038/nature10721

5. Redecke, L., Nass, K., DePonte, D., White, T., Rehders, D., Barty, A., Stellato, F., Liang, M., Barends, T., Boutet, S. et al. (2012). Natively Inhibited Trypanosoma brucei Cathepsin B Structure Determined by Using an X-ray Laser Science, 339 (6116), 227-230 DOI: 10.1126/science.1229663

6. Tajemnicą niezbadaną pozostaje dla mnie to, dlaczego redaktorzy Science piszą o tym, jako nie tylko pierwszej, ale także jedynej strukturze białkowej uzyskanej z pomocą ksazerów: nie jestem pewien w takim razie, co dokładnie przedstawiały badania opisane rok wcześniej w Nature dla fotosystemu I, które zresztą prowadzone były z użyciem tego samego instrumentu…

7. Inokuma, Y., Yoshioka, S., Ariyoshi, J., Arai, T., Hitora, Y., Takada, K., Matsunaga, S., Rissanen, K., & Fujita, M. (2013). X-ray analysis on the nanogram to microgram scale using porous complexes Nature, 495 (7442), 461-466 DOI: 10.1038/nature11990

Advertisements

3 Comments

  1. Fizycy nie wybaczają :)

    „Po drugie promieniowanie lasera jest zbieżne; to oznacza, że przekrój wiązki pozostaje taki sam nawet bardzo daleko od źródła.”

    Z tą zbieżnością to już trochę poszło za daleko. Światło laserowe jest spójne przestrzennie, co oznacza, że można uformować zbieżną na długim dystansie wiązkę. Nie jest to jednak jakaś cecha promieniowania laserowego, a na pewno nie można powiedzieć, że przekrój wiązki pozostaje taki sam ;)

    I zastanawiam się jeszcze co znaczy u licha, że laser Nd:YAG jest groźny ;)?

    Lubię

    1. Coś mi się umyśliło, że wiele badawczych laserów Nd:YAG jest klasy czwartej, ale szczerze mówiąc chyba całkiem pokręciłem. Także ten element opisu już usunąłem. Resztę zostawiam, ponieważ wyjaśniłeś nieścisłość w swoich komentarzu :)

      Lubię

Skomentuj

Wprowadź swoje dane lub kliknij jedną z tych ikon, aby się zalogować:

Logo WordPress.com

Komentujesz korzystając z konta WordPress.com. Log Out / Zmień )

Zdjęcie z Twittera

Komentujesz korzystając z konta Twitter. Log Out / Zmień )

Facebook photo

Komentujesz korzystając z konta Facebook. Log Out / Zmień )

Google+ photo

Komentujesz korzystając z konta Google+. Log Out / Zmień )

Connecting to %s