Złap bakcyla

W ubiegłym roku pisałem dość (względnie) dużo o problemie antybiotyko-opornych bakterii i tego, że przemysł farmaceutyczny w ostatnich dekadach ma bardzo kiepskie wyniki w kwestii produkcji nowych rodzajów antybiotyków. Medialna histeria (histeria, w której powinniśmy byli trwać od dawna, ale która nagłośniona została dopiero w zeszłym roku) zaczęła się w okolicach maja wraz z publikacją długiego raportu Światowej Organizacji Zdrowia na temat oporności mikroorganizmów.

Dla Czytelników nicprostszego ani raport, ani jego wnioski nie były chyba zaskoczeniem, gdyż o rosnącym problemie lekooporności pisałem kilka razy w 2013 roku: opisując prace na temat ewolucji lekooporności prątka gruźlicy, a także dość rewolucyjne odkrycie związku Q203, który ma potencjał stać się nowym, efektywnym lekiem przeciw tej bakterii.

Prątki gruźlicy (M.tuberculosis) widziane pod mikroskopem elektronowym.
Prątki gruźlicy (M.tuberculosis) widziane pod mikroskopem elektronowym.

Niemniej jednak jedna jaskółka wiosny nie czyni. Dlatego tak ważna jest praca, która pojawiła się w piśmie Nature (1) w pierwszej połowie stycznia – o której, jak sądzę, część z Czytelników na pewno słyszała. Praca opisuje odkrycie nowego rodzaju antybiotyku przeciwko dość szerokiemu spektrum bakterii, a ciekawa jest nie tylko przez wzgląd na identyfikacją tego nowego związku, ale też przez wzgląd na zastosowaną metodologię.

Ciężki los poszukiwaczy antybiotyków

Strategia poszukiwania antybiotyków, którą stosowano w czasach złotej ery ich odkrywania (głównie lata czterdzieste i pięćdziesiąte ubiegłego stulecia) została zaproponowana jednak dekady wcześniej przez niemieckiego badacza Paula Ehrlicha (2). Ehrlich stworzył koncept magicznego pocisku (lub naboju albo kuli, w zależności od tego, na jakie tłumaczenie „magic bullet” uda się Wam trafić): leku, który jest selektywny tylko w stosunku do zarazka powodującego jakąś chorobę, a który nie czyni szkody choremu.

W poszukiwaniu takiego magicznego pocisku na początku dwudziestego stulecia Ehrlich rozpoczął prawdopodobnie pierwszy program przesiewowy, którego celem było znalezienie leku na syfilis. Wraz z dwójką swoich kolegów, Alfredem Bertheimem oraz Sahachiro Hatą, zsyntetyzował setki różnych pochodnych związków arsenoorganicznych. Związki te badacze testowali na zarażonych syfilisem królikach. Hitem okazał się związek numer – bagatela – 606 (3). Chociaż bardziej współczesne badania przesiewowe nie zaczynają się być może od pół tysiąca królików, to wkład pracy potrzebny do znalezienia nowego działającego leku jest niewiele mniejszy.

Przy tym systematycznym podejściu do poszukiwań odkrycie penicyliny przez Fleminga można określić jako mocno przypadkowe. Tak naprawdę jednak ani pieczołowicie zaplanowane odkrycie Ehrlicha, ani łut szczęścia Fleminga nie oddają tego, w jaki sposób odkryto znakomitą większość współczesnych antybiotyków. Fleming miał w tym jednak swoją niemałą rolę, projektując metodę przesiewowego badania bakterii pod kątem ich oporności na różne substancje.

Antybiotyki w przyrodzie produkowane są zaś przede wszystkim (być może paradoksalnie) przez bakterie. Przez lata zatem badacze hodowali bakterie – te które dało się hodować w laboratorium – i izolowali z nich nowe związki, które następnie testowali na innych bakteriach. Problem pojawił się jednak w momencie, gdy przetestowano wszystkie bakterie, które byliśmy w stanie zmusić do wzrostu w warunkach laboratoryjnych.

Pisałem kiedyś o tym, że liczba bakterii, które potrafimy hodować w laboratorium jest tak naprawdę niewielka. Prawda jest taka, że warunki laboratoryjne z definicji nie są naturalne – są bowiem środowiskiem kontrolowanym. Te zatem bakterie, które przebadaliśmy już w laboratoriach na całym świecie na dziesiątą stronę, to niekoniecznie bakterie, które są najgroźniejsze, najciekawsze lub najprzydatniejsze. Nie, większość z tych bakterii przebadaliśmy dlatego, bo po prostu chciały rosnąć na agarze.

Kiedy więc wyczerpały się te bakteryjne zasoby, pod koniec XX wieku badacze zwrócili się w stronę poszukiwania środków działających znacznie bardziej specyficznie. Rozwój genetyki pozwolił oczywiście zsekwencjonować wiele bakterii i opisać dokładnie ich geny. Skoro więc zamknęła się dla nas możliwość poszukiwania związków naturalnych, przeszukiwać zaczęliśmy ogromne biblioteki związków syntetycznych: wiedząc, który gen bakterii jest dobrym celem dla nowego leku, można przewidzieć – modelując to komputerowo – jaka powinna być, z grubsza, struktura związku. Potem jest to już tylko kwestia przetestowania setek, a nawet tysięcy, związków z tej samej grupy czy rodziny.

Koncept takiego dezajnerskiego antybiotyku – takim lekiem jest np. Q203 – jest niegłupi. Ale nie oznacza to, że łatwo jest odkryć związek, który się będzie nadawał. Po oprócz określonego działania na dany gen bakterii, taki związek musi spełnić jeszcze kilka innych warunków. Przede wszystkim nie może być oczywiście szkodliwy dla pacjenta. Ponadto, musi mieć strukturę pozwalającą mu przedostać się w ten czy inny sposób przez ścianę i błonę komórkową bakterii. Cóż nam bowiem po leku, który działa świetnie, gdy znajdzie się we wnętrzu bakteryjnej komórki, jeśli nie potrafimy go do tego wnętrza wprowadzić?

Jeśli zatem zastanawiacie się, dlaczego warto martwić się coraz większą opornością bakterii na antybiotyki, to jest właśnie odpowiedź: samo odkrycie efektywnego, bezpiecznego związku graniczy z cudem. Do tego zaś należy dodać, że proces testowania takiego związku trwać może – od odkrycia do aptecznych półek – 15 lat (4), w trakcie których może okazać się, że nowy lek z wyścigu z bakteriami odpadnie na którymkolwiek z etapów. Łatwo zatem zrozumieć, na czym polega nasz problem w sytuacji, gdy w fazie testowej jest obecnie zaledwie kilka związków, które nawet jeśli wreszcie trafią do aptek, to mogą tam trafić za późno.

Jak przekonać bakterie, że jednak powinny rosnąć

Biorąc pod uwagę to, że połowa (5) leków dostępnych obecnie do użytku jest pochodzenia bakteryjnego, nic dziwnego, że od lat wielu badaczy próbuje wypracować metody hodowania bakterii, które do tej pory nie zostały dogłębnie zbadane. Szacuje się, że poprawnie opisanych jest obecnie około 7 tysięcy gatunków bakterii. Że jest to liczba niewielka, biorąc pod uwagę ich różnorodność, można się przekonać porównując ją z liczbą gatunków znacznie bardziej skomplikowanych – na przykład żuków, których znamy około 400 tysięcy (!!).

Z drugiej strony szacuje się, że te 7 tysięcy to mniej niż jeden procent wszystkich gatunków bakterii (prawdopodobnie dość sporo mniej). To, że opisano ich tak niewiele wynika właśnie z tego, że aby bakterię poprawnie opisać i sklasyfikować, trzeba móc ją wyhodować. Jeśli więc ten niewielki odsetek bakterii odpowiada za połowę znanych nam leków, nietrudno wyobrazić sobie monstrualny potencjał tej grupy organizmów jako źródła kolejnych nowych obiecujących związków.

Prawdopodobnie najbardziej obiecująca z nowych metod, opracowana przez autorów pracy w Nature – Lewisa i Epsteina – już ponad dekadę temu, opiera się na założeniu, że przyczyną, dla której bakterie nie chcą rosnąć w laboratorium jest to, że nie potrafimy odtworzyć warunków naturalnych – że w naszych eksperymentach zawsze brakuje jakiegoś krytycznego elementu. Może jest to jakiś związek obecny w naturalnym otoczeniu bakterii, który jest jej niezbędny do funkcjonowania. Może jest to temperatura albo wilgotność. A może obecność innych organizmów. Żeby zatem móc takie bakterie hodować w laboratorium, trzeba jak najlepiej symulować warunki naturalne (czyli paradoksalnie: stworzyć kontrolowane środowisko niekontrolowane). Jak autorom się to udało, o tym za moment. Najpierw rzućmy szybko okiem na dwie inne metody, które rozwinęły się w oparciu o podobną filozofię (5).

Jedną z ciekawszych obserwacji poczynionych przez Lewisa i Epsteina było to, że niektóre bakterie nie chciały rosnąć, gdy w okolicach nie było innych – ściśle określonych – bakterii. Powodów do tego może być wiele, ale najbardziej oczywistym, który przychodzi do głowy, jest to, że jeden gatunek produkuje jakiś związek, który jest potrzebny do życia drugiemu. Te relacja może być jednak bardziej subtelna: bowiem metodą stosowaną do hodowania takich bakterii są tzw. ko-kultury, w których bakterię, którą chcemy uzyskać, hoduje się wraz z jej niezbędnym partnerem, którego na późniejszym etapie hodowli można wybić antybiotykiem.

Inną zupełnie metodykę stosować można (i trzeba) do hodowli bakterii, których naturalnym środowiskiem jest wnętrze innych organizmów: takich jak na przykład nasze bakterie jelitowe. U takich bakterii brakującym elementem może być jakiś czynnik produkowany przez gospodarza, obecność innych bakterii, albo jedno i drugie. Łatwo sobie wyobrazić, że tutaj wyzwaniem jest stworzenie warunków przypominających naturalne. W badaniach nad bakteriami jelitowymi stosuje się jednak na przykład specjalne myszy, które nie posiadają żadnych bakterii jelitowych – można u nich wówczas wprowadzić do jelit dowolnie zdefiniowaną florę jelitową (np. stosując kałowe przeszczepy). Ich jelita stają się wówczas naturalnym inkubatorem dla bakterii zawartych w tej próbce.

Jednak metoda opracowana przez Lewisa i Epsteina jest prawdopodobnie najbliższa odtworzeniu środowiska naturalnego bakterii w warunkach laboratoryjnych – chociaż stosować ją można przede wszystkim do bakterii środowiskowych, czyli tych występujących na przykład w wodzie lub ziemi. Metodę tę opisali w piśmie Science w 2002 roku (6): stworzyli komorę do hodowli bakterii, której podstawę stanowiła przepuszczalna membrana. Bakterie wyizolowano z próbek, a następnie naniesiono na membranę w tej komorze. Komorę następnie umieszczono na powierzchni pokrytej tą samą próbką. W ten sposób składniki zawarte w próbce, które były niezbędne do życia bakterii, mogły się swobodnie przemieszczać do komory, ale rosnące w niej bakterie nie mogły się z tej komory wydostać. W ten sposób udało im się dramatycznie zwiększyć liczbę gatunków bakterii, które uzyskali z próbki w porównaniu do standardowej metody hodowania ich na agarze.

W ramach oddawania sprawiedliwości muszę tutaj dodać, że zaledwie kilka miesięcy później tygodnik Nature opublikował pracę innej grupy opisującej bardzo podobne rozwiązanie (7). Obie metody jednak miały tę samą wadę: w ten sposób dało się wyhodować znacznie więcej gatunków bakterii, ale wciąż była to ich mieszanka. Droga do izolacji pojedynczych gatunków była wciąż daleka.

Następnym – krytycznym – etapem w rozwoju tej technologii było opracowanie (i opisanie w 2010 roku) mikroczipu służącego nie tylko do hodowli, ale i do izolacji nowych gatunków bakterii (ang. isolation chip, nazwany też iChipem, (8)). Koncepcyjnie czip jest nieskomplikowany: zamiast jednej dużej komory zawiera po prostu setki małych. Zamiast zapełniać komory roztworem wyizolowanych z próbki bakterii, cały czip zanurza się w pojemniku z roztworem. Ze względu na rozmiar komór, do membrany w każdej z nich przylega zazwyczaj tylko jedna – rzadko dwie lub kilka – komórka bakteryjna. Dalsza procedura jest taka sama jak w oryginalnej metodzie, ale rezultatem jest to, że w większości komór rośnie tylko jeden gatunek bakterii.

Schemat konstrukcyjny iChipu. /Przedruk za zgodą Macmillan Publishers Ltd.: Ling et al. Nature (2015), 517: 455
Schemat konstrukcyjny iChipu. /Przedruk za zgodą Macmillan Publishers Ltd.: Ling et al. Nature (2015), 517: 455

Uzbrojeni w tę nową wydajną technologię, która ma szansą znacznie poszerzyć nasze możliwości w zakresie odkrywania nowych antybiotyków i innych związków o potencjalnym działaniu terapeutycznym, Lewis i Epstein skierowali swoją uwagę w stronę praktycznego zastosowania, opisanego w najnowszej publikacji.

Sekrety teiksobaktyny

Badacze wyizolowali 10 tysięcy (porównajcie do to opisanych siedmiu tysięcy gatunków!) różnych bakterii z najpospolitszego ze źródeł: 1 grama ziemi pochodzącej z łąki w stanie Maine. Po uzyskaniu wystarczającej ilości bakterii, autorzy biologiczną masę zamienili na ekstrakty (czyli kultury bakterii potrawili i przekształcili w bezkształtną zupę zawierającą jednak związki przez te bakterie wyprodukowane). Te ekstrakty zostały następnie przebadane pod kątem ich aktywności antybakteryjnej przeciwko gronkowcowi złocistemu.

Wyniki dla jednego z ekstraktów były bardzo obiecujące; autorzy skupili się zatem na tej jednej bakterii, której materiał genetyczny zsekwencjonowano (rozwój technologii sekwencjonowania DNA i RNA pozwala nam dzisiaj wykonać taki eksperyment niezwykle szybko). Bakterię wstępnie nazwano Eleftheria terra, a dzięki znajomości jej sekwencji DNA udało się ją też sklasyfikować. Z ekstraktu wyizolować zaś udało się związek odpowiedzialny za antygronkowcową aktywność E.terra.

Związkiem tym okazał się być peptyd, któremu nadano dźwięczne imię: teiksobaktyna. Teiksobaktyna jest bardzo szczególnym peptydem, ponieważ w jej skład wchodzi kilka bardzo niestandardowych aminokwasów: enduracydydyna (proszę się nie martwić, jeśli o nim nie słyszeliście), metylofenyloalanina, a także cztery aminokwasy D (są to optyczne izomery aminokwasów wchodzących w skład białek – jednak wszystkie białka produkowane w organizmach żywych przez rybosomy, to izomery L).

Struktura chemiczna teiksobaktyny.
Struktura chemiczna teiksobaktyny.

Teiksobaktyna okazała się być związkiem niezwykle skutecznym przeciwko wielu groźnym mikrobom z grupy bakterii Gram-dodatnich (w odróżnieniu np. od Q203, który działa przede wszystkim na M.tuberculosis), wliczając w to liczne szczepy oporne na znane antybiotyki. Do grupy bakterii czułych na teiksobaktynę należą trudne w leczeniu enterokoki, prątki gruźlicy, opisywana przeze mnie kiedyś, wredna Clostridium difficile, laseczki wąglika, no i oczywiście gronkowiec.

Większość bakterii Gram-ujemnych była na teiskobaktynę oporna – wyłączając niektóre szczepy z uszkodzeniami błony komórkowej. Jednak próby uzyskania gronkowca i prątków gruźlicy opornych na ten lek (robi się to hodując wiele pokoleń bakterii na podłożu zawierającym niewielkie ilości antybiotyku) nie powiodły się – jest to więc wynik znakomity. Z drugiej strony teiksobaktyna testowana na komórkach ssaczych nie wykazywała żadnej toksyczności. Czyli mówiąc w skrócie: jest związkiem, który jest względnie bezpieczny dla nas, ale jednocześnie śmiertelny dla szerokiego spektrum bakterii.

Niezwykle ciekawym elementem publikacji jest opisany mechanizm działania nowego antybiotyku. Wskazówką tutaj zapewne jest jego działanie na niektóre bakterie Gram-ujemne z uszkodzoną błoną, a przede wszystkim to, że bakterie nie potrafią wytworzyć oporności na związek. Sugeruje to, że działa on nie na białka – oporność bakterie uzyskałyby po prostu poprzez mutacje genu kodującego dane białko – ale na inne składniki komórki. Taki efekt opisano już wcześniej dla wankomycyny, która działa wiążąc się do lipidu II będącego prekursorem budującego ścianę bakterii peptydoglikanu. Autorzy spekulowali, że działanie teiksobaktyny jest podobne – i rzeczywiście ich wyniki wskazały na to, że teiksobaktyna wiąże się z lipidem II.

Tu jednak podobieństwa do wankomycyny się kończą. Ten antybiotyk wiąże się bowiem z peptydową częścią lipidu II (który wbrew nazwie nie jest tylko lipidem, ale ma część lipidową, cukrową oraz peptydową): D-alaniną. Istnieją już niestety bakterie oporne na ten antybiotyk: są to te mikroby, które D-alaninę zastąpiły innym aminokwasem. Okazuje się jednak, że teiksobaktyna jest skuteczna przeciwko tym wankomycynoopornym mikroorganizmom. Dodatkowo teiksobaktyna wiąże też inne związki będące prekursorami budulców ściany komórkowej: lipid I oraz lipid III.

Interesujące jest zwłaszcza wiązanie do lipidu III: hamuje ono syntezę kwasu tejchojowego. Kwas ten, oprócz budowania ściany komórkowej bakterii, pełni też ważną funkcję regulacyjną: zapobiega samotrawieniu bakterii przez enzymy z grupy autolizyn. Jego brak w komórce bakteryjnej jest zatem krytyczny.

Magiczny nalot dywanowy – i co dalej?

Teiksobaktyna nie jest zaledwie magicznym pociskiem opisywanym przez Paula Ehrlicha, gdyż jej działanie jest bardzo szerokie. Chociaż zatem magiczne, przypomina raczej nalot dywanowy. Wyniki testów zwierzęcych są także niezwykle obiecujące. Co ważniejsze, to badanie stanowi tylko bardzo, ale to bardzo obiecujący początek nowej ery eksploracji, skutkiem której nie cofniemy się może jednak do epoki kamienia łupanego, a operacja usuwania wyrostka robaczkowego pozostanie tym, czym jest w chwili obecnej – dość standardową procedurą.

Niemniej jednak warto dodać na koniec słowo przestrogi: wspomniałem już wcześniej, że okres od odkrycia nowego potencjalnego leku do jego aptecznej obecności może zająć więcej niż dekadę. Ten element procesu nie uległ niestety zmianie, a większość tego czasu – jak również znakomitą większość środków finansowych przeznaczanych na badania nad nowymi farmaceutykami – zajmują kolejne fazy badań klinicznych. Więc nawet jeśli teiksobaktyna, jak również kolejne związki, które niewątpliwie wkrótce odkryjemy, okaże się być tak skuteczna i bezpieczna, jak nam się w tej chwili wydaje, i tak może minąć kolejna dekada zanim zobaczymy jej zastosowanie poza laboratorium czy szpitalem badawczym. I musimy mieć nadzieję, że stara gwardia antybiotyków da radę do tego czasu utrzymywać szereg.

Przypisy:

1. Ling, L., Schneider, T., Peoples, A., Spoering, A., Engels, I., Conlon, B., Mueller, A., Schäberle, T., Hughes, D., Epstein, S., Jones, M., Lazarides, L., Steadman, V., Cohen, D., Felix, C., Fetterman, K., Millett, W., Nitti, A., Zullo, A., Chen, C., & Lewis, K. (2015). A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance Nature, 517 (7535), 455-459 DOI: 10.1038/nature14098

2. Aminov, R. (2010). A Brief History of the Antibiotic Era: Lessons Learned and Challenges for the Future Frontiers in Microbiology, 1 DOI: 10.3389/fmicb.2010.00134

3. Ciekawostką jest, że do dzisiaj nie znamy mechanizmu działania tego leku, zaś jego struktura została rozwiązana zaledwie 10 lat temu – blisko 100 lat po jego odkryciu.

4. Payne, D., Gwynn, M., Holmes, D., & Pompliano, D. (2006). Drugs for bad bugs: confronting the challenges of antibacterial discovery Nature Reviews Drug Discovery, 6 (1), 29-40 DOI: 10.1038/nrd2201

5. Stewart, E. (2012). Growing Unculturable Bacteria Journal of Bacteriology, 194 (16), 4151-4160 DOI: 10.1128/JB.00345-12

6. Kaeberlein, T. (2002). Isolating „Uncultivable” Microorganisms in Pure Culture in a Simulated Natural Environment Science, 296 (5570), 1127-1129 DOI: 10.1126/science.1070633

7. Rappé, M., Connon, S., Vergin, K., & Giovannoni, S. (2002). Cultivation of the ubiquitous SAR11 marine bacterioplankton clade Nature, 418 (6898), 630-633 DOI: 10.1038/nature00917

8. Nichols, D., Cahoon, N., Trakhtenberg, E., Pham, L., Mehta, A., Belanger, A., Kanigan, T., Lewis, K., & Epstein, S. (2010). Use of Ichip for High-Throughput In Situ Cultivation of „Uncultivable” Microbial Species Applied and Environmental Microbiology, 76 (8), 2445-2450 DOI: 10.1128/AEM.01754-09

Advertisements

3 Comments

  1. użyto 1g gleby, – ziemia jest pojęciem zbyt ogólnym, gleba jest prawidłowym określeniem ( np. mamy organizmy glebowe). Ale artykuł super, bardzo dobrze napisany. Pozdrawiam

    Lubię to

Skomentuj

Wprowadź swoje dane lub kliknij jedną z tych ikon, aby się zalogować:

Logo WordPress.com

Komentujesz korzystając z konta WordPress.com. Log Out / Zmień )

Zdjęcie z Twittera

Komentujesz korzystając z konta Twitter. Log Out / Zmień )

Facebook photo

Komentujesz korzystając z konta Facebook. Log Out / Zmień )

Google+ photo

Komentujesz korzystając z konta Google+. Log Out / Zmień )

Connecting to %s