Polowe sekwencjonowanie z odsieczą w walce z zarazą

Ebola/źródło: NIAID (domena publiczna)

28 sierpnia 2014 roku magazyn Science opublikował ważną pracę [1]: wyniki sekwencjonowania 99 genomów wirusa Ebola. Próbki pozyskano od 78 pacjentów na wczesnym etapie epidemii w Sierra Leone. Od momentu bowiem potwierdzenia w tym kraju pierwszych przypadków zachorowań na wirusa w maju zeszłego roku, badacze współpracujący z lokalnymi władzami oraz pracownikami organizacji pozarządowych, takich jak WHO czy Lekarze Bez Granic, rozpoczęli wysyłkę próbek do Instytutu Broad – jednostki badawczej w Bostonie, w której prowadzone są zaawansowane badania genetyczne.

Tam z próbek wyizolowano materiał genetyczny wirusa, który był następnie sekwencjonowany i analizowany. A wyniki tych analiz pozwoliły nam zrozumieć, jak rozpoczęła się trwająca wciąż epidemia oraz w jaki sposób wirus ewoluował w jej trakcie.

Publikacja miała olbrzymie znaczenie zarówno naukowe, jak i medyczne, i stała się znakomitym przykładem pokonywania problemów praktycznych. Naukowcy biorący udział w badaniu opracowali na przykład nowe metody – zarówno laboratoryjne jak i obliczeniowe – które służyć nam będą pomocą przy okazji kolejnych epidemii (niekoniecznie wirusa Ebola).

Przeszkody naukowe to jedno, ale trudno sobie nawet wyobrazić morze biurokracji, które badacze musieli pokonać, aby zdobyć pozwolenie na wywóz biologicznie groźnych próbek z Afryki – oraz ich wwóz do Stanów Zjednoczonych. Taki transport musiał też niemało kosztować, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że próbki wysyłane były ciurkiem na bieżąco, a nie za jednym zamachem. Badanie, koniec końców, niektórych z badaczy kosztowało też życie – i jest to być może jedna z najbardziej bolesnych lekcji, jakie mogliśmy dostać.

Pomimo tego wszystkiego można i tak wciąż powiedzieć, że publikacja ukazała się zbyt późno: zbyt późno dla 1500 osób, które zmarło przed końcem sierpnia (i prawdopodobnie za późno dla kolejnych 8500, które zmarło od tamtej pory). Dzisiaj możemy zaś tylko spekulować: gdyby sekwencjonowanie było technologią łatwo dostępną w krajach dotkniętych epidemią na jej wczesnym etapie, czy jest możliwe, że choroba zostałaby znacznie wcześniej rozpoznana, a jej rozprzestrzenianie się – zahamowane?

Ebola/źródło: NIAID (domena publiczna)
Ebola/źródło: NIAID (domena publiczna)

Odpowiedź na to pytanie nie jest łatwa (o ile w ogóle jest możliwa). Stwierdzenie, że gdyby lekarze i badacze pracujący w Afryce mieli łatwy i szybki dostęp do technologii, wówczas być może nie mówilibyśmy dzisiaj w ogóle o epidemii, jest nieco niesprawiedliwą oceną pracy tychże lekarzy, którzy od początku stali w obliczu niemal niemożliwej sytuacji (zwłaszcza że wiemy, jak wielkie znaczenie miał czynnik ludzki, żeby nie powiedzieć: kulturowy).

Gdyby jednak spróbować rozdzielić te dwie kwestie: emocjonalne i skomplikowane okoliczności towarzyszące epidemii Eboli w Afryce oraz abstrakcyjny scenariusz walki z hipotetyczną epidemią w nibylandii, wówczas można pokusić się o odpowiedź na pytanie: czy genetyczne monitorowanie epidemii w czasie rzeczywistym nie jest przyszłością w walce z chorobami zakaźnymi? Bo przecież, oczywiście, musi być. Koń jaki jest, każdy widzi.

MinION pomaga pokonać Salmonellę

W jaki sposób jednak można monitorować epidemię w czasie rzeczywistym z zastosowaniem najnowszych technologii genomicznych? Najprostszym – co nie znaczy najtańszym – rozwiązaniem byłoby postawienie sekwencera w każdym szpitalu na Ziemi. O ile jednak takie maszyny powoli stają się standardem w dużych szpitalach w Stanach Zjednoczonych, Wielkiej Brytanii, Niemczech, Chinach, czy Korei, w znakomitej większości krajów o takim luksusie możemy jedynie pomarzyć.

A gdy już przestaniemy marzyć, pozostaje nam zapytać: czy istnieje bardziej realistyczna opcja alternatywna? I, o dziwo, odpowiedź brzmi ‘tak’! I jest wynikiem najnowszych osiągnięć w zakresie technologii sekwencjonowania – sekwencjonowania za pomocą nanoporów [2].

Cofnijmy się zatem w czasie, znowu do lata 2014 roku. Mniej więcej w tym samym czasie, gdy badacze z Instytutu Broad cierpliwie zbierali próbki Eboli, w Wielkiej Brytanii wybuchła inna epidemia. I chociaż o tej zarazie media nie wspomniały prawie w ogóle, ma ona niesamowite znaczenie dla niniejszej historii, gdyż szpital, w którym do niej doszło, stał się polem ćwiczebnych manewrów.

W czerwcu 2014 roku w szpitalu Heartlands w Birmingham na skutek nagłej epidemii salmonelli doszło do zamknięcia ośmiu oddziałów. Wybuch epidemii okazał się fortunny o tyle, że w na Uniwersytecie Birmingham pracuje znakomita grupa mikrobiologów, z których co najmniej jeden, Nick Loman, jest entuzjastycznym fanem technologii sekwencjonowania za pomocą nanoporów. Dzięki temu młodzieńczemu zapałowi był on jednym z pierwszych badaczy bardzo aktywnie zaangażowanych w program wczesnego dostępu do technologii, który dwa lata temu rozpoczęła firma Oxford Nanopore Technologies (ONT) – jedyny, jak na razie, producent działającego sekwencera wykorzystującego nanopory.

Wspaniałą cechą tego urządzenia, które ONT ochrzciło MinIONem, jest nie tylko wykorzystanie technologii nanoporów, która pozwala na sekwencjonowania bardzo długich fragmentów DNA [3], ale także to, że urzadzenie jest jedynie odrobinę większe niż pendrive. Innymi słowy, można je włożyć do kieszeni i wyruszyć w podróż na drugi koniec świata, a tam wyjąć i użyć do sekwencjonowania… czegokolwiek.

Nick Loman i Peter Hawkey wraz ze współpracownikami postanowili zatem sprawdzić, czy MinION może być zastosowany do rozpoznania szczepu Salmonelli szalejącego w szpitalu Heartlands. Wyniki tych prób zostały właśnie opublikowane w Genome Biology [4].

Sekwencjonowanie i analiza za pomocą MinIONa są fantastycznie szybkie. /źródło: Quick et al., Genome Biology (2015), 16: XX
Sekwencjonowanie i analiza za pomocą MinIONa są fantastycznie szybkie. /źródło: Quick et al., Genome Biology (2015), 16: XX

Badanie podkreśla dwa (co najmniej) imponujące aspekty technologii reprezentowanej przez MinIONa. Po pierwsze, jest ono pierwszą demonstracją zastosowania przenośnego sekwencera do monitorowania epidemii. Wyniki zweryfikowano co prawda poprzez tradycyjne sekwencjonowanie, jednak są one dowodem, że urządzenie możnaby skutecznie zastosować w warunkach polowych, w których większe, droższe maszyny są po prostu niedostępne.

Drugim aspektem była sama prędkość uzyskania wyników. Po przygotowaniu próbek do analizy (procedura ta będzie trwać mniej więcej tyle samo niezależnie od tego, jakie urządzenie stosujemy), samo sekwencjonowanie i analiza były wyjątkowo szybkie: badacze zidentyfikowali gatunek Salmonella enterica w ciągu mniej niż pół godziny. W ciągu kolejnych 50 minut udało im się ustalić, że za zarażenia odpowiedzialny byl serotyp Enteritidis, zaś po kolejnych 100 minutach wiedzieli też, że serotyp ten należy do klastra, który może prowadzić do epidemii. Innymi słowy, w ciągu trzech godzin wiedzieli, z czym się mierzą i jak z tym walczyć.

Wdrażanie teorii w praktyce

Skoro wiemy już zatem, że przenośne sekwencery działają równie dobrze, jak standardowe tradycyjne maszyny, jedyne co nam pozostaje to przetestowanie ich w polu: sprawdzenie, czy można ich użyć w miejscu, gdzie inne możliwości technologiczne są ograniczone – i czy wiedza zdobyta w ten sposób może pomóc w budowaniu odpowiedniej strategii walki z chorobą.

I to właśnie dzieje się teraz. Na początku maja Nature doniosło o podróży, którą Joshua Quick, pierwszy autor pracy w Genome Biology, odbył w kwietniu. Quick spakował dwie małe walizki, w których zmieścił 3 MinIONy, maszynę do PCR, odczynniki i kilka innych niezbędnych narzędzi (pipety i końcówki!). I tak przygotowany wyjechał do Gwinei, gdzie w jednym z największych (co wcale nie znaczy, że dobrze wyposażonych) szpitali oczekiwał na niego pusty pokój.

W tym pokoju Quick urządził polowe laboratorium i przez kolejnych 12 dni sekwencjonował na potęgę, analizując ostatecznie próbki 14 pacjentów, które na bieżąco – w chmurze – analizowane były przez jego promotora, Nicka Lomana, który robił to prawdopodobnie siedząc wygodnie w fotelu w jakimś pubie w Birmingham. Jedna z tych próbek została zbadana i przeanalizowana w ciągu zaledwie 48 godzin od pobrania krwi od pacjenta, ilustrując tempo w jakim przenośne sekwencery dostarczyć mogą niezbędnych informacji epidemiologicznych.

Zapakowany osprzęt i laboratorium w Gwinei. /zdjęcia dzięki uprzejmości Nicka Lomana i Josha Quicka z Uniwersytetu w Birmingham
Zapakowany osprzęt i laboratorium w Gwinei. /zdjęcia dzięki uprzejmości Nicka Lomana i Josha Quicka z Uniwersytetu w Birmingham

Warto tutaj zaznaczyć, że projekt Quicka i Lomana nie jest jedynym tego rodzaju: w połowie maja w Londynie odbyły się warsztaty zorganizowane przez ONT dla uczestników ich programu wczesnego dostępu do technologii. W czasie warsztatów dwóch innych badaczy, Miles Carroll z Public Health England oraz Thomas Hoenen z NIH, opowiadało o udziale w projektach, które wykorzystują MinIONy do monitorowania Eboli w Afryce. Z kolei Yutaka Suzuki z Uniwersytetu w Tokio opisał podobne starania w Indonezji – do monitorowania gorączki Dengue.

Wszystko to pokazuje, że jesteśmy na granicy niesamowitego postępu w epidemiologii: już teraz, przy okazji kolejnej dużej epidemii, możliwe będzie jej monitorowanie w czasie rzeczywistym i w miejscu, w którym do niej dojdzie. A informacje na temat zarazka zdobyte w ten sposób są raczej nie do przecenienia.

Przypisy:

1. Gire, S., Goba, A., Andersen, K., Sealfon, R., Park, D., Kanneh, L., Jalloh, S., Momoh, M., Fullah, M., Dudas, G., Wohl, S., Moses, L., Yozwiak, N., Winnicki, S., Matranga, C., Malboeuf, C., Qu, J., Gladden, A., Schaffner, S., Yang, X., Jiang, P., Nekoui, M., Colubri, A., Coomber, M., Fonnie, M., Moigboi, A., Gbakie, M., Kamara, F., Tucker, V., Konuwa, E., Saffa, S., Sellu, J., Jalloh, A., Kovoma, A., Koninga, J., Mustapha, I., Kargbo, K., Foday, M., Yillah, M., Kanneh, F., Robert, W., Massally, J., Chapman, S., Bochicchio, J., Murphy, C., Nusbaum, C., Young, S., Birren, B., Grant, D., Scheiffelin, J., Lander, E., Happi, C., Gevao, S., Gnirke, A., Rambaut, A., Garry, R., Khan, S., & Sabeti, P. (2014). Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak Science, 345 (6202), 1369-1372 DOI: 10.1126/science.1259657

2. Zdaję sobie oczywiście sprawę, że po wstępnych wpisach o sekwencjonowaniu Sangera i sekwencjonowaniu przez syntezę moja seria genomowa obumarła. Postaram się sekwencjonowanie za pomocą nanoporów wyjaśnić w osobnym wpisie wkrótce, zwłaszcza że koncept nie jest skomplikowany – a w jakiejś mniej lub bardziej nieodległej przyszłości wyjaśnię też, w jaki sposób wyniki sekwencjonowania, czyli sekwencje długości kilkuset, góra kilka tysięcy nukletydów, przekłada się na pełną sekwencję genomu (u ludzi: trzy miliardy!), a także powiem może więcej o sekwencjonowaniu nowej generacji, nazywanym też sekwencjonowaniem trzeciej generacji (nanopory są generacją czwartą).

3. Nie będę wnikał w szczegóły, powiem tylko, że technologia ta teoretycznie prowadzić powinna do mniejszej ilości błędów w sekwencjonowaniu, a ponadto potrzeba znacznie mniej materiału biologicznego niż w przypadku innych urządzeń.

4. Quick J, Ashton P, Calus S, Chatt C, Gossain S, Hawker J, Nair S, Neal K, Nye K, Peters T, De Pinna E, Robinson E, Struthers K, Webber M, Catto A, Dallman TJ, Hawkey P, Loman NJ (2015). Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella Genome Biology, 16: 114; 10.1186/s13059-015-0677-2

5. Wpis jest spolszczoną i minimalnie zmienioną wersją angielskiego oryginału.

1 Comment

Skomentuj

Wprowadź swoje dane lub kliknij jedną z tych ikon, aby się zalogować:

Logo WordPress.com

Komentujesz korzystając z konta WordPress.com. Log Out / Zmień )

Zdjęcie z Twittera

Komentujesz korzystając z konta Twitter. Log Out / Zmień )

Facebook photo

Komentujesz korzystając z konta Facebook. Log Out / Zmień )

Google+ photo

Komentujesz korzystając z konta Google+. Log Out / Zmień )

Connecting to %s