Redakcja inżynierii nierówna (w genetyce)

Jakiś czas temu, po jednym z moich wpisów o redagowaniu genomu, jedna z Czytelniczek bloga zadała zasadne dosyć pytanie: jaka jest różnica pomiędzy GMO a organizmami ze zredagowanym genomem? Zwłaszcza w sytuacji, gdy wszyscy dookoła ubolewają, że jednym z największych problemów z jakim zmagają się techniki redagowania genomu, są modyfikacje niespecyficzne – to samo, na co narzekają rzesze przeciwników GMO.

W tym wpisie chciałbym tę różnicę pokrótce wyjaśnić – na przykładzie roślin, gdyż znakomita większość GMO, z którym mamy do czynienia, to genetycznie modyfikowane rośliny uprawne.

Co to znaczy, że organizm jest genetycznie zmodyfikowany?

Organizmy modyfikowane genetycznie to organizmy, których geny zostały zmodyfikowane poprzez zastosowanie technik inżynierii genetycznej. Brzmi to może jak masło maślane, ale definicja jest dosyć istotna, ponieważ wynika z niej jasno, że za genetycznie modyfikowane nie uważa się organizmów otrzymanych na drodze hodowli, poprzez zapłodnienie in vitro, mutagenezę i kilka innych powszechnie stosowanych metod.

I można się tu kłócić, czy jest to definicja słuszna czy nie – bowiem zaryzykowałbym stwierdzenie, że dobór hodowlany jest znacznie mniej precyzyjną i często znacznie bardziej szkodliwą formą inżynierii genetycznej. Ale jest jaka jest i na tym poprzestańmy.

Często też organizmy modyfikowane nazywa się transgenicznymi, chociaż to akurat nie jest określenie ścisłe. Pochodzi ono od nazwy trzech rodzajów zmian genetycznych, które można wprowadzać w tych organizmach. Po pierwsze zatem, do organizmu można wprowadzić gen pochodzący z kompletnie innego gatunku. Taki obcy gen nazywa się transgenem, a zmianę – modyfikacją transgeniczną.

Po drugie można też jednak do organizmu wprowadzić gen pochodzący z tego samego gatunku (ale na przykład innej odmiany) albo z gatunku bardzo blisko spokrewnionego. Taki gen nazywa się cisgenem, a zmianę – modyfikacją cisgeniczną. Chociaż takiej zmiany można dokonać w laboratorium, znacznie łatwiej uzyskać ją poprzez dobór hodowlany – co jest możliwe właśnie dzięki dużemu stopniowi pokrewieństwa.

Po trzecie wreszcie, można zmiany w organizmie dokonać poprawiają precyzyjnie geny już w tym organizmie istniejące – taka zmiana, którą nazywać można subgeniczną, to redagowanie genomu, które opisywałem kiedyś na Podwójnej Helisie, a niedawno także w Wiedzy i Życiu.

Niemniej jednak, najczęściej gdy mowa o organizmach transgenicznych, na myśli mamy (bardziej lub mniej świadomie) organizmy rzeczywiście transgeniczne.

Jak tworzy się organizmy transgeniczne?

Pierwszym krokiem w procesie jest ustalenie, jaki gen chcemy do organizmu wprowadzić. To samo w sobie jest procesem niełatwym i pracochłonnym. Zazwyczaj bowiem próbujemy w organizmie wywołać określoną zmianę fenotypową – a ta nie zawsze ma oczywiste podłoże genetyczne. Załóżmy jednak, że wiemy już, co chcemy zrobić. Na przykład chcielibyśmy, żeby uprawiane przez nas pomidory produkowały białka, które działają jak insektycyd – białka, które naturalnie w tych pomidorach nie występują.

Do pomidora musimy zatem wprowadzić gen produkujący to białko. Faza pierwsza (I) jest to zatem izolacja tego genu z organizmu, w którym naturalnie występuje. Ten fragment DNA musimy następnie wprowadzić do plazmidu (jest to faza (II)), cyklicznej cząsteczki DNA, która służy jako wehikuł do transportu naszego genu. Plazmidy mają to do siebie, że są niezależne od DNA chromosomowego i mogą się niezależnie od niego powielać (występują zaś najczęściej w bakteriach, chociaż znane są przypadki obecności plazmidów u organizmów wyższych). Tę ich właściwość wykorzystuje się w fazie (III): plazmid wprowadzany jest do bakterii. Hodując bakterię namnażamy także i plazmid.

transgenics

Bakterią wykorzystywaną przy tworzeniu roślin transgenicznych jest najczęściej bakteria Agrobacterium tumefaciens. Jest to bakteria Gram-ujemna występująca naturalnie w glebie, która jest groźnym patogenem atakującym między innymi orzechy, winogrona, czy buraki cukrowe. U roślin tych powoduje wzrost guzów.

Wirulentność tej bakterii wynika z obecność plazmidu indukującego guzy, plazmidu Ti, który zawiera tzw. T-DNA, DNA transferowe, które bakteria wprowadza do komórek gospodarza. W procesie produkcji roślin transgenicznych transgen staje się właśnie T-DNA.

Gdy namnożymy już wystarczającą ilość bakterii zawierającej nasz plazmid, pozostaje nam bakterię podać rosnącym roślinom. Bakteria jest wówczas naturalnie wchłaniana, a gdy dostanie się do rośliny robi to, co robi najlepiej – rozprowadza plazmid z naszym transgenem po całym organizmie. W trakcie tej fazy (IV) istotne jest, aby roślina była na takim etapie rozwoju, na którym produkuje komórki rozrodcze, bowiem modyfikacja przez plazmid z transgenem komórek somatycznych nie jest oczywiście dziedziczna. Tylko modyfikacja komórek rozrodczych zagwarantuje, że otrzymamy w kolejnym pokoleniu rośliny, w których każda komórka posiada wprowadzony transgen.

Na koniec – w fazie (V) – pozostaje nam czekać aż bakteria zrobi swoje.

Ostatnim (nie do końca, ale ostatnim na potrzeby tekstu) etapem jest selekcja potomstwa, które ma wbudowany transgen. U roślin można to zrobić w bardzo elegancki sposób (u zwierząt jest to nieco trudniejsze): wraz z transgenem do rośliny wbudowuje się gen oporności na antybiotyk. Nowe nasiona hoduje się na pożywce z tym antybiotykiem – rosną tylko te, które posiadają gen oporności, a wraz z nim pożądany transgen.

Losowa natura procesu: modyfikacje transgeniczne a redakcja genomu

Wprowadzenie do organizmu transgenu jest procesem dosyć losowym w tym sensie, że nie możemy przewidzieć, gdzie w genomie organizmu dojdzie do zmiany – i czy to losowe wbudowanie nie spowoduje jakichś problemów. I tu właśnie objawia się pierwsza zasadnicza różnica między genetycznym modyfikowaniem, a genetycznym redagowaniem. W trakcie redagowania zmiana zachodzi dokładnie tam, gdzie chcemy.

Oczywiście redagowanie genomu nie jest perfekcyjne. Technologia jest bardzo nowa, narzędzia wciąż dopracowywane. Chociaż sama identyfikacja miejsca w genomie, które chcemy zmodyfikować, jest znacznie bardziej precyzyjne niż stare technologie modyfikowania genetycznego, sposób naprawy DNA lub jego modyfikacji oraz mechanizm naprawy przeciętej nici, a także wydajność całego procesu – to są wszystko czynniki, które wciąż wymagają ulepszeń i optymalizacji.

Druga różnica pomiędzy genetycznym modyfikowaniem i redagowaniem jest różnicą na poziomie nie technologii lecz genetyki. Jeśli weźmiemy organizm zmodyfikowany genetycznie tradycyjnymi metodami, z wbudowanym transgenem, i zsekwencjonujemy jego DNA, to analiza sekwencji ujawni nam, że organizm jest genetycznie zmodyfikowany. Może to być na przykład dlatego, że znajdziemy w nim ślady T-DNA. Albo dlatego, ze odkryjemy sekwencję transgenu w miejscu, gdzie jej być nie powinno – np. w środku innego ważnego genu.

W przypadku redagowania genomu po modyfikacji DNA nie pozostaje ślad. Stąd też bierze się wiele problemów natury regulacyjnej – czy organizm, w którym nie jesteśmy w stanie zidentyfikować modyfikacji genetycznej, można nazwać genetycznie modyfikowanym? A jeśli nie – to oczywiście zmieniają się reguły gry w kwestii testowania, w kwestii rozpowszechniania, w kwestii sprzedaży. I aktywiści oponujący wprowadzaniu GMO będą się być może zacietrzewiać, ale prawda jest taka, że nie ma – z genetycznego punktu widzenia – różnicy między organizmem, w którym jakiś gen został wyredagowany w laboratorium, a organizmem, w którym ten sam gen przeszedł losową mutację.

A zatem stoi przed nami otworem nowy, wspaniały świat. Z jednej strony: możliwość niemal dowolnego modyfikowania genów, aby tworzyć organizmy lepiej dostosowane, zdrowsze, bardziej użyteczne. Z drugiej strony: możliwość zmian, które mogą mieć daleko idące konsekwencje, a których nie jesteśmy w stanie nawet wykryć. Nie ma zatem wątpliwości, że musimy stworzyć nowe mechanizmy kontroli tych technologii. Z drugiej jednak strony, powinniśmy możliwości, które ze sobą niesie, przyjąć z otwartymi szeroko ramionami.

Advertisements

9 Comments

  1. GMO to przyszłość.

    Ja uważam, że za jakieś 100 czy 200 lat genetyka pójdzie w tą stronę, że naukowcy wymyślą jak ludziom mogą odrosnąć ręce czy nogi po amputacji.

    Jeszcze 100 lat temu było nie do pomyślenia np. przeszczep serca, a taki Rockefeller miał już robioną transplantację 6 razy i jest to dzisiaj zwykła codzienność. Tak samo jak kiedyś było nie do pomyślenia, że z komórki bez kabla wyślemy wiadomość w sekundę na drugi koniec świata.

    Amerykanie najwięcej inwestują właśnie w biotechnologie. To jest przyszłość, a nie żaden kosmos, to później!

    Lubię to

  2. @Zaciekawiony

    Szereg modyfikacji, które polegają na dodaniu/usunięciu/wymianie nukleotydów w DNA przyjęło się określać terminem edytowanie genomu.

    @Rafał

    Cisgeneza to nie GMO (według definicji). A GMO to nie tylko inżynieria genetyczna. Organizm uzyskany w wyniku fuzji protoplastów to GMO.

    Lubię to

    1. No właśnie ostatnio spotkałem się z opinią, że regadowanie genomu – a więc i cisgeneza – jest GMO. Definicje naukowe mają to do siebie, że – niezależnie od tego, jak dane pojęcie rozumiane jest w świetle prawa – zawsze znajdą się conajmniej dwa naukowe obozy, które mają na dany temat odmienne zdania.

      Osobiście uważam, że te terminy nie są jednakie i cisgeneza w ogóle, czy redagowanie genomu rozumiane tak, jak to zdefiniowałem na blogu, nie powinny się kwalifikować jako GMO. Ale debata pewnie będzie jeszcze trwać latami.

      Lubię to

      1. Ja mam na myśli definicje używane w prawie, które implikują poważne konsekwencje = GMO musi przechodzić proces autoryzacji; prace nad GMO podlegają kontroli; etc.
        Organizm cisgenetyczny nie jest GMO w ujęciu prawnym.

        Opinie naukowe to już inna sprawa. Tutaj rzecz jest dużo bardziej skomplikowana. W moim odczuciu każda z technik polegająca na modyfikacji cech organizmu żywego powinna być określana jako GMO – począwszy od selekcji, konwencjonalną hodowlę, mutagenezę, transgenezę po najbardziej wyrafinowane techniki inżynierii genetycznej. Stawianie jakiejś granicy, że GMO to inżynieria genetyczna prowadzi na manowce. Bo np. edytowanie genomów jest w pewnym sensie bardzo podobne do mutagenezy, powoduje zmiany sekwencji nukleotydów, tyle że w przypadku tej ostatniej jest ich dziesiątki tysięcy lub miliony, ale powiedzmy na poziomie DNA jest to bardzo podobne.
        Myślę, że czas na poważną debatę nad porzuceniem kwalifikacji organizmu jako GMO poprzez patrzenie na technikę jego uzyskania. Chociaż w Europie to jeszcze daleka droga do takiego myślenia, ale na świecie już zmierza się w tym kierunku vide Kanada, USA (powoli).

        Definicja GMO jest bardzo nieprecyzyjna i implikuje szereg problemów. Szczególnie w ostatnim czasie narosło wiele kontrowersji w odniesieniu do nowych technologii inżynierii genetycznej. I nie chodzi tylko o CRISPR, ale i inne.

        W zeszłym miesiącu nad tym tematem pochylił się nawet Komitet Biotechnologii PAN:
        http://www.kbiotech.pan.pl/images/pdfy/stanowisko_Komitetu_Biotechnologii_PAN_w_sprawie_nowych_technik_inzynierii_genetycznej_17-07-2015.pdf

        Lubię to

  3. „Jeśli weźmiemy organizm zmodyfikowany genetycznie tradycyjnymi metodami, z wbudowanym transgenem, i zsekwencjonujemy jego DNA, to analiza sekwencji ujawni nam, że organizm jest genetycznie zmodyfikowany.”
    (…)”W przypadku redagowania genomu po modyfikacji DNA nie pozostaje ślad.”

    Na pewno? Przecież sekwencja raczej nie pozostanie taka sama – inaczej, po co ją redagować? Ergo – sekwencjonowanie docelowego genu powinno pokazać różnice w porównaniu z sekwencją organizmu-biorcy („rodzicielskiego”).

    Also,
    Jakiś czas temu pytałem na researchgate o możliwości transgenezy specyficznej do sekwencji:

    „There are at least 2 ways we can narrow down the random insertion of transgenes in the genomes when doing plant genetic transformation.

    1. Site-specific recombination (SSR) system- mediated gene integration. Most SSR systems derive from microbes or lower eukaryotes such as yeast. A transgene can be directed to a pre-determined ‚landing-pad’ (at a locus) through the site-specific recombination between a specific sequence on the landing pad and a specific sequence on a plasmid carrying your gene-of-interest. Please visit my profile for this topic.

    2. Designer nuclease (such as ZFN, TALEN etc)- mediated gene integration at a specific locus through homologous recombination. Designer nucleases cause DNA double-stranded breaks (DSBs) at a specific locus. The cellular DSB repair systems will kick in to fix the break, including a homologous recombination (HR) mechanism. By providing a donor plasmid with your gene-of-interest, this gene can be integrated into the specific locus through HR.”

    Inny kolega wskazał system wirusowy jako punkt startowy: http://www.nottingham.ac.uk/ncmh/documents/bger/volume-19/bger19-11.pdf

    Lubię to

    1. Marcinie – po pierwsze, wielkie dzięki za ten wartościowy komentarz. Nie twierdzę, że znam odpowiedzi na wszystkie pytania, ale postaram się odpowiedzieć i tak :)

      Całkowicie się z Tobą zgadzam, że genom wyredagowany można rozpoznać sekwencjonując genom rodzica. Co więcej, w ten dokładnie sposób w badaniach naukowych potwierdza się, że do redakcji doszło (bo proces ma małą wydajność, więc nie zawsze w końcu do tego dochodzi). Mnie chodzi jednak o sytuację, w której nie mamy dostępu do rodzica.

      Czyli na przykład: idziesz na targ i kupujesz nową odmianę pomidorów, które są większe i bardziej soczyste. Możesz takiego pomidora oczywiście zsekwencjonować i porównać do innych odmian, i prawdopodobnie nawet znajdziesz sporo różnic, ale nie będziesz w stanie stwierdzić, czy różnice są efektem ingerencji laboratoryjnej, czy po prostu talentem rolnika.

      Warto też dodać, że różnice są często na poziomie pojedynczych nukleotydów – w ten osób planuje się leczyć wiele chorób np. krwi, które często są rezultatem takich małych mutacji. I zmiana tej mutacji z powrótem na zdrową wersję genu jest czymś, czego też byśmy nie wykryli (nie mając wcześniej wiedzy o chorobie). Bo to, co się za pomocą redagowania robi, to nie zmiana genu w całości, ale tylko zmiana na inną jego wersję – a większość genów w populacji istnieje w dużej liczbie wersji, z których zresztą większość jest funkcjonalna (powiedzmy: ‚zdrowa’).

      Co do specyficzności i innych metod (stosujących SSR): wydaje mi się (chociaż tutaj zapędzamy się na głębsze wody), że to, o czym mówi ten autor, to sytuacja, w której w genomie znajduje się locus, o którym wiemy, że można tam wpakować transgen bez zagrożenia, że spowodujemy w nim jakieś szkody. Dlatego takie miejsca w genomie często stosuje się właśnie jako rodzaj magazynu transgenów. Nie wiem, czy to najszczęśliwsze określenie, ale mam problem ze znalezieniem lepszego słowa na landing pad – ja się spotkałem też z określniem ‚safe harbour’, które lepiej oddaje sens. W ludzkim genomie takim miejscem jest np. locus AAVS1.

      Różnica polega jednak na tym, że programowalne nukleazy zapewniają nie tylko specyficzne cięcie DNA – to zapewniają przecież enzymy restrykcyjne, które znamy w końcu prawie od pół wieku – ale przede wszystkim na tym, że miejsce, które chcemy ciąć, możemy wybrać dowolnie. Czego z klasycznymi enzymami restrykcyjnymi zrobić nie możemy.

      Na ostatni link rzucę okiem po powrocie z pracy ;)

      Lubię to

      1. Dziękuję za odpowiedź Gospodarzu ;)
        To tylko moje czepialstwo na niezbyt fortunny skrót myślowy/uproszczenie w oryginalnym poście – i oczywiście kompletnie zgadzam się w wywodem powyżej.

        Lubię to

    1. Dobre pytanie, odpowiedzi nie mam. Poza tym, że w przypadku usunięcia genu też raczej nei bylibyśmy w stanie stwierdzić, czy modyfikacja jest losowa, czy też doszło do niej dzięki interwencji człowieka…

      Lubię to

Skomentuj

Wprowadź swoje dane lub kliknij jedną z tych ikon, aby się zalogować:

Logo WordPress.com

Komentujesz korzystając z konta WordPress.com. Log Out / Zmień )

Zdjęcie z Twittera

Komentujesz korzystając z konta Twitter. Log Out / Zmień )

Facebook photo

Komentujesz korzystając z konta Facebook. Log Out / Zmień )

Google+ photo

Komentujesz korzystając z konta Google+. Log Out / Zmień )

Connecting to %s