Siedmiomilowy krok od terapii na chorobę Duchenne’a

maxresdefault

Dystrofia mięśniowa Duchenne’a to ciężka choroba genetyczna występująca wyłącznie u chłopców. Choroba jest dość rzadka – występuje w jednym na 3600 urodzeń. Po raz pierwszy opisało ją dwóch Włochów w latach trzydziestych XIX wieku, ale jak to zwykle bywało we wczesnych latach współczesnej medycyny, nie im przypadł zaszczyt nazwania choroby swoim imieniem – tego (nieco wątpliwego) zaszczytu dostapił francuski neurolog, Guillaume Duchenne, który kazus tej choroby opisał w 1861 roku.

Jak wskazuje nieco specjalistyczna nazwa tego schorzenia, choroba powoduje postępujący zanik mięśni. Wywoływana jest zaś przez mutacje w genie DMD kodującym dystrofinę – białko występujące w komórkach mięśniowych odpowiedzialne za wiązanie cytoszkieletu komórki z błoną (białko to odpowiada za stabilność komórek mięśniowych). Gen DMD jest zlokalizowany na chromosomie X – właśnie dlatego choroba występuje niemal wyłącznie u chłopców, którzy nie posiadają zdrowego allelu, który mógłby zrekompensować skutki mutacji.

Dystrofia Duchenne’a jest jedną z posterowych chorób badanych pod kątem leczenia terapiami genowymi. Powód jest prosty – choroba jest powodowana przez mutację punktową w jednym genie, co oznacza, że teoretycznie powinna być względnie prosta do wyleczenia tą techniką (oczywiście w teorii).

Grupa Charlesa Gersbacha z Uniwersytetu Duke temat leczenia dystrofii Duchenne’a wałkuje od jakiegoś czasu. Ich wcześniejsze badania skupiały się na zastosowaniu nukleaz z motywem palców cynkowych (ZFN) oraz nukleaz TALE. Dwa i pół roku temu w piśmie Molecular Therapy grupa opisała właśnie zastosowanie TALENów do naprawy eksonu 51 w genie dystrofiny. Badanie przeprowadzono na liniach komórkowych uzyskanych od pacjentów z dystrofią – wprowadzona modyfikacja w tychże komórkach prowadziła do wzrostu poziomu dystrofiny do poziomu zdrowych komórek. Na początku 2015 roku w tym samym piśmie badacze opisali naprawę tej samej mutacji za pomocą nukleaz ZF.

Wiemy jednak, że największą nadzieję wszyscy pokładają w technologii CRISPR/Cas. W lutym badacze opisali zastosowanie właśnie tej techniki w Nature Communications. Jedną z największych zalet CRISPR/Cas w porównaniu z pozostałymi metodami redagowania genów jest prostota z jaką da się dokonywać więcej niż jedną modyfikację na raz. Tym razem badacze skupili się na jednej mutacji, ale na tuzinach, wszystkich zlokalizowanych między eksoneami 45 i 55 w genie DMD. Sprawdzili też, jaki wpływ na poziom dystrofiny ma usunięcie niewielkich fragmentów tego genu – jak również usunięcie rejonu zawierającego 10 eksonów (czyli dosyć dużego). Wszystkie te eksperymenty prowadziły do ponownego wzrostu poziomu dystrofiny, chociaż można zastanawiać się nad jej funkcjonalnością po usunięciu jej fragmentów (z drugiej strony wiadomo, że niektóre białka mają domeny, które nie są niezbędne do ich prawidłowego działania). Aby sprawdzić, czy tak naprawiona dystrofina działa w prawidłowy sposób, naukowcy wszczepili naprawione ludzkie komórki myszom (takie doświadczenie nazywa się ksenotransplantacją). Po kilku tygodniach sprawdzili, czy rozrastające się u myszy naprawione komórki ludzkie są prawidłowe pod kątem lokalizacji i działania dystrofiny – no i okazało się, że i owszem były.

Wszystko to oznacza, że mamy narzędzia do naprawienia mutacji powodującej chorobę Duchenne’a. Czy te narzędzia będzie dało się jednak zastosować u pacjentów, to już zupełnie inna, wcale nie prostsza, kwestia. Przyczyny są zasadniczo dwie: jedna techniczna, druga zaś prawna.

Z technicznego punktu widzenia problem polega na tym, że aby wyleczyć pacjenta z choroby Duchenne’a, należałoby się upewnić, że wszystkie jego komórki mają naprawiony gen DMD. Jest tylko jedna metoda, aby to zrobić – należy te komórki naprawić, gdy pacjent jest jeszcze we wczesnym stadium zarodkowym (inną opcją byłby przesiew komórek jajowych matki i zapłodnienie in vitro, ale szcze mówiąc nie wiem nawet, jak taki przesiew miałby wyglądać, gdyż nie znam metody, która pozwoliłaby określić, czy komórka jajowa posiada zdrowy, czy zmutowany allel na chromosomie X, bez niszczenia tejże komórki). Modyfikowanie zarodków zaś – abstrahując od przyczyny prawnej – to procedura znacznie bardziej skomplikowana niż modyfikowanie komórek somatycznych, chociażby dlatego, że skuteczność redagowania jest bardzo niska, zaś reagenty do komórek/embrionów wstrzykuje się za pomocą mikroiniekcji, która jest metodą praco- i czasochłonną.

Z prawnego punktu widzenia – cóż, tutaj odeślę już tylko do moich niedawnych tekstów na temat prawno-moralnych dylematów związanych z redagowniem genomu. Mówiąc krótko: łatwo nie jest, a chociaż pacjenci chcieliby już teraz widzieć zastosowanie tych technik do leczenia różnych chorób genetycznych (poruszający artykuł o pacjencie z chorobą Huntingtona zobaczyć możecie tutaj), to zarówno badacze, jak i lekarze, prawnicy i etycy są znacznie bardziej ostrożni.

Sytuacja prawna zmieniać się będzie – przynajmniej w niektórych rejonach świata, niekoniecznie w Polsce, czy nawet w większości krajów europejskich, które do modyfikacji genetycznych podchodzą sceptycznie – prawdopodobnie bardzo szybko. Dobrze by zatem było, aby technologia nadążąła za tymi zmianami. Więc jedną z pierwszych rzeczy, o które powinniśmy pytać, to czy technologię da się zastosować do naprawy genu u ssaków (czyt. najpewniej doświadczalnych gryzoni).

I jak donoszą trzy prace opublikowane z impetem na koniec roku 2015 (w sylwestrową noc, aby przypadkiem nikt nie zauważył): da się, a do tego da się to zrobić bez redagowania linii zarodkowej.

Myszy wyleczone redagowaniem genów z dystrofii mięśniowej. /źródło: BBC
Myszy wyleczone redagowaniem genów z dystrofii mięśniowej. /źródło: BBC

Wszystkie trzy prace opublikowane zostały w piśmie Science i opisują naprawę mysiego odpowiednika genu DMD – genu mdx. W pracach badano w różnym stopniu możliwość naprawy tego genu u myszy prenatalnych, postnatalnych i dorosłych (nie jestem pewien, czy różnica między dwoma ostatnimi nie jest tylko w nazewnictwie), a także możliwość ich naprawy lokalnie lub systemowo (czyli w całym organizmie).

Po kolei zatem.

Praca pierwsza została opublikowana przez grupę Erica Olsona z UT Southwestern. Badacze podawali myszom mieszankę reagentów, których zadaniem była naprawa komórek, począwszy od myszy jednodniowych aż po myszy 18 dniowe (i począwszy od iniekcji dootrzewnowej do iniekcji wewnątrzmięśniowej). Wyniki były raczej pomyślne, co dobrze rokuje zwłaszcza w kontekście nieredagowania embrionów. Wydajność z jaką po terapii poprawia się poziom dystrofiny w komórkach rósł z wiekiem myszy, co równieć jest dobrym znakiem, bo oznacza, że naprawione komórki pracują poprawnie. Dość interesujące było to, że autorzy nie zaobserwowali żadnych problemów z niespecyficznymi modyfikacjami genów – które sa dużym problemem techniki CRISPR/Cas (interesujące jest to dlatego, że autorzy nie potrafią tego wytłumaczyć. Nigdy nie jest dobrym znakiem, gdy nie wiemy, dlaczego coś działa – bo nie będziemy wówczas wiedzieli jak zareagować, gdy działać przestanie).

Praca druga została opublikowana przez grupę George’a Churcha, który jest w biologii molekularnej legendą (ja zaś bardzo go idolizuję, więc moje peany musicie traktować z przymrużeniem oka), ze wsparciem Fenga Zhanga. Ci badacze także przetestowali zastosowanie techniki CRISPR/Cas lokalnie i systemowo (poprzez wstrzyknięcie reagentów dootrzewnowo myszom trzydniowym). Tu techniczną nowinką były małe modyfikacje techniki – zastosowanie innej niż zazwyczaj wersji białka Cas (SaCas zamiast SpCas, które jest znacznie mniejsze) oraz innego niż zazwyczaj promotora. Dzięki tym zmianom wszystkie cząsteczki niezbędne do redagowania mogły zostać wprowadzone do komórki za pomocą jednego, i do tego niewielkiego, wektora. Poziom dystrofiny, podobnie jak w pracy Olsona, udało się podnieść, chociaż autorzy zaznaczają, że naprawa genu zachodziła z różną wydajnością.

Wreszcie praca trzecia to kolejna odsłona badań nad chorobą Duchenne’a z grupy Gersbacha. Spośród tych trzech publikacji jest też chyba najambitniejsza w tym sensie, że oprócz prób naprawy genu mdx u myszy dorosłych badacze przetestowali też terapię u myszy neonatalnych. Podobnie jak grupa Churcha, naukowcy zastosowali wersję SaCas białka Cas9.

Wszystkie te prace potwierdzają jedną, znaną od niedawna, kwestię – do prawidłowego funkcjonowania organizmu wystarczy, aby tylko część komórek została naprawiona. Wystarczy, aby jej funkcjonalność została poprawiona tylko w 4% (czyli np. 4 na sto komórek zostało naprawionych, albo naprawa we wszystkich komórkach prowadzi do 4% wzrostu poziomu białka – jak dokładnie te 4% się objawia jest mniej istotne), aby zapobiec objawom choroby Duchenne’a. To tłumaczy, dlaczego nie jest w tym przypadku jednak redagowanie genomu wszystkich komórek organizmu. Oznacza też, że pacjenci z tą chorobą nie będę jednak musieli czekać na niewątpliwe potyczki prawne, jakie toczone są i będą wokół redagowania linii zarodkowej.

Tak więc jesteśmy już tylko krok od skutecznej terapii na tę nieprzyjemną chorobę. Jak to zwykle jednak bywa, jest to krok raczej duży, a badania opublikowane tydzień temu są tylko obiecującym dowodem działania (ang. proof-of-principle). Na zastosowanie kliniczne wciąż będziemy musieli trochę poczekać.

4 Comments

  1. Artykuł ciekawy, ale jest jeden duży błąd cyt ,,Powód jest prosty – choroba jest powodowana przez mutację punktową w jednym genie, co oznacza, że teoretycznie powinna być względnie prosta do wyleczenia tą techniką” DMD jest spowodowane delecją, duplikacją lub mutacją punktową a nie tylko mutacją punktową. Czy metoda CRISPR/Cas dotyczy tylko mutacji punktowych czy innych mutacji również?

    Liked by 1 osoba

    1. Rzeczywiście – wytknięto mi już na fejsie, ale zapomniałem poprawić tutaj. Mutacją punktową jest jednak spowodowane schorzenie w mysim modelu. Ogólnie rzecz biorąc jednak, z punktu widzenia terapii opisanej w tych publikacjach jest to bez znaczenia, ponieważ terapia odbywa się poprzez przesunięcie otwartej ramki odczytu – a to z kolecji odbywa się poprzez delecję czy to fragmentu eksonu, czy to dużego fragmentu zajmującego 10 eksonów.

      Warto zatem tutaj podkreślić, że stosowana tutaj wersja CRISPR/Cas jest wersją nieco prostacką w tym sensie, że nie naprawia ona mutacji, a raczej ją usuwa (ponieważ naprawa DNA odbywa się poprzez mechanizm scalania niehomologicznych końców DNA raczej niż rekombinację homologiczną). Gdyby DNA było naprawiane poprzez rekombinację homologiczną, zmiana byłaby znacznie bardziej precyzyjna – co ważne przy leczeniu chorób, gdzie nie wystarczy tylko usunąć fragment DNA. Problem polega na tym, że ta forma naprawy DNA ma znacznie mniejszą wydajność (i mówimy tutaj o różnicach z gatunku dwóch rzędów wielkości – od np. 20-50% przy NHEJ, do ułamków procenta przy HR). Więc do takich terapii droga jest nieco dalsza.

      Lubię

  2. „Dość interesujące było to, że autorzy nie zaobserwowali żadnych problemów z niespecyficznymi modyfikacjami genów – które sa dużym problemem techniki CRISPR/Cas (interesujące jest to dlatego, że autorzy nie potrafią tego wytłumaczyć. ”

    Tak sobie głośno myślę, że to iż nie zaobserwowano niespecyficznego działania na inne geny to nie znaczy, że do niego nie doszło (po prostu brak przełożenia na fenotyp?). Z drugiej strony to, że przy CRISPR dochodzi do niespecyficznego działania, to nie znaczy, że musi być to reguła obowiązująca w każdym przypadku i można założyć, że zaprojektowany przez nich konstrukt był wysoce specyficzny?

    Lubię

    1. Właśnie o to chodzi, że standardowe narzędzia do CRISPR/Cas nie są aż tak specyficzne. Wynika to być może z tego, że fragment RNA, który służy do rozpoznania miejsca cięcia, jest dosyć krótki – to oznacza, że ilość kombinacji nukleotydów jest względnie niewielka, a to z kolei, że w genomie jest więcej niż jedno miejsce odpowiadające takiej sekwencji.

      Dodatkowo znaczenie może mieć nie tylko sekwencja, ale też trójwymiarowa struktura DNA. Wyobraź sobie, że miejsce, które chcesz ciąć, znajduje się na fragmencie chromatyny nawiniętym na histon. Wówczas Cas9 będzie miało większe problemy z tym, żeby się do takiej sekwencji dostać.

      Oddziaływania niespecyficzne CRISPR/Cas były od początku większą bolączką tej technologii niż w przypadku ZFNów i TALENów. Co ciekawe, w ostatnim miesiącu ukazały się dwie prace (F. Zhanga z grudniu, w Science, oraz Keitha Jounga w Nature wczoraj bodajże) opisujące warianty enzymu Cas, które są wysoce specyficzne. Więc ta bolączka może bolączką nie pozostać już długo.

      Lubię

Skomentuj

Wprowadź swoje dane lub kliknij jedną z tych ikon, aby się zalogować:

Logo WordPress.com

Komentujesz korzystając z konta WordPress.com. Log Out / Zmień )

Zdjęcie z Twittera

Komentujesz korzystając z konta Twitter. Log Out / Zmień )

Facebook photo

Komentujesz korzystając z konta Facebook. Log Out / Zmień )

Google+ photo

Komentujesz korzystając z konta Google+. Log Out / Zmień )

Connecting to %s