Runął kolejny domek z kart

Pół roku temu pisałem o tym, jak w gruzach legła praca z 2016 roku opisująca enzym NgAgo, który miał być – potencjalnie – ważnym konkurentem systemu CRISPR/Cas9. W ciągu zaledwie tygodni od publikacji badacze na całym świcie zaczęli donosić – najsampierw w mediach społecznościowych – że nowa metoda nie działa. Potem przyszły doniesiania oficjalne, a wreszcie w sierpniu retrakcja pracy. Do tej pory jednak nie wiemy na pewno, i pewnie nigdy się nie dowiemy, czy problemy w oryginalnym badaniu były wynikiem fałszerstwa, czy też po prostu rezultatem niedopatrzeń ze strony autorów.

Niezależnie od tego jednak, czy NgAgo poległo przez kłamstwa czy przez niekompetencję, praca była – wydawało mi się tak przynajmniej śledząc rozwój sytuacji – ważnym sygnałem dla naukowców pracujących nad rozwojem nowych technologii redagowania genomu, że potrzeba w ich badaniach więcej rygoru. Że być może za dużo jest w tym środowisku parcia na szkło lub, ściślej, na papier prestiżowych periodyków oraz podań patentowych.

Oczywistą oczywistością było więc to, że po fiasku NgAgo każda głośna publikacja dotycząca nowych czy ulepszonych technik redagowania genomu znajdzie się pod lupą – innych badaczy oraz mediów. Pewnym zaskoczeniem było zatem, gdy w maju zeszłego roku1 pismo Nature Methods opublikowało pracę grupy amerykańskich badaczy opisującą, jakie spustoszenie w genomie sieje CRISPR/Cas9.

O czym dokładnie jest ta praca? Badacze przeprowadzili eksperyment, w którym dokonali naprawy mutacji w genie Pde6b u myszy (czyli in vivo). W takim doświadczeniu do redagowania genomu dochodzi na etapie wczesnego stadium zarodkowego. Z takich zarodków uzyskano następnie myszy, które poddano sekwencjonowaniu całego genomu, aby sprawdzić, czy CRISPR/Cas9 cięło/naprawiało tylko ten jeden gen, czy też być może operowało też – nieplanowo – na innych fragmentach genomu.

Skąd w ogóle założenie, że CRISPR/Cas9, które zostało przecież ochrzczone narzędziem nie tylko łatwym w obsłudze, ale przede wszystkim precyzyjnym, może ciąć nie tam, gdzie powinno? Opisywałem na blogu wcześniej, że do identyfikacji sekwencji docelowej stosowany jest komplementarny fragement RNA (sgRNA). sgRNA w podstawowej wersji techniki CRISPR/Cas9 ma długość 22 nukleotydów. Jest to fragment na tyle długi, że szansa na występowanie dokładnie takiej samej sekwencji w wielu miejscach genomu jest nikła – ale jednak niezerowa. Po pierwsze zatem możliwe jest, że nasza sekwencja docelowa nie jest unikalna dla genu, który chcemy zredagować.

W dodatku, CRISPR/Cas9 nie jest systemem całkowicie wiernym – to znaczy, że może rozpoznawać i ciąć sekwencje, które nie są całkowicie komplementarne do sgRNA, ale różnią się jedną, dwoma, a nawet kilkoma zasadami. Ta właściwość wynika z tego, w jakim cely system CRISPR/Cas9 pierwotnie wyewoluował: jako narzędzie do rozpoznawania sekwencji wirusowych przez bakterie. Zdolność rozpoznawania i niszczenia nie tylko sekwencji znanych, ale także tych blisko spokrewnionych, zwiększa wszechstronność CRISPR/Cas9 w walce z wirusami. Zmniejsza jednak jego użyteczność do precyzyjnej redakcji genomu.

A precyzyjna redakcja genomu to w chwili obecnej święty Graal medycyny (a przynajmniej jeden z wielu).

Autorzy publikacji w Nature Methods chcieli zatem sprawdzić, czy CRISPR/Cas9 powoduje wiele takich mutacji pobocznych. Sekwencjonowanie całego genomu pozwoliło im przyjrzeć się zmianom w sekwencji DNA w skali globalnej. Następnie zidentyfikowali dwa rodzaje mutacji: indele (czyli albo małe insercje albo małe delecje – dodatek albo ubytek krótkiego fragmentu DNA) oraz warianty pojedynczych nukleotydów (SNV), czyli mutacje punktowe. Mutacje identyfikuje się poprzez porównanie sekwencji genomu do genomu myszy kontrolnej.

No i okazało się, że jedna z myszy – F03 – miała 164 indele oraz ponad 1,700 mutacji punktowych. Druga – F05 – 128 indeli oraz blisko 1,700 mutacji punktowych. Co więcej, 117 indeli oraz prawie 1,400 mutacji punktowych było takie same u obu myszy, co zdaniem autorów sugeruje, że mutacje te są skutkiem CRISPR/Cas9 (bo u obu myszy system powinien teoretycznie rozpoznawać te same sekwencje DNA). Ta obserwacja była dalej potwierdzona tym, że żadna z tych nowych mutacji nie występuje w genomach referencyjnych 36 innych mysich szczepów. Co ważne, większośc z tych mutacji znajdowała się w regionach, dla których stopień komplementarności z sgRNA był bardzo niewielki – i żadna z nich nie znajdowała się w 50 najbardziej prawdopodobnych lokalizacjach przewidzianych przez algorytm.

Autorzy wysunęli więc taką tezę: CRISPR/Cas9 działa niezwykle efektywnie, ale jest nieprecyzyjne jak pieron i może prowadzić do wielu nieprzewidywalnych zmian w genomie. Powinniśmy zatem do wyników badań z tym systemem podchodzić bardzo ostrożnie oraz prowadzić więcej badań nad zwiększaniem „wierności” systemu.

Publikacja sama w sobie jest meh. Przede wszystkim metodologicznie – co jest zresztą od razu wytknięto – ale także i wnioski nie są aż tak porażające, jak to się może na pierwszy rzut oka wydawać. Że CRISPR/Cas9 nie jest takie super precyzyjne, jak nam to czasem przedstawiają massmedia w środowisku badawczym jest tajemnicą poliszynela. Zresztą wersji tej metody istnieje już bardzo, bardzo wiele, a większość z tych wersji ma celu między innymi poprawienie właśnie wierności enzymu Cas9. Nie jest jednak oczywiste, której wersji metody użyto do produkcji myszy w tym badaniu. Niemniej jednak media podchwyciły temat bardzo chętnie – tak bardzo, że akademickie spinouty próbujące komercjalizować tę technikę do zastosowań medycznych (a wszystkie weszły już na giełdę), straciły w ciągu kilku dni od 7 do 16% na wartości.

Równie szybko pracy zaczęli przyglądać się jednak badacze i już dzień po jej publikacji na blogu Paula Knoeplfera, który pracuje w dziedzinie komórek macierzystych i z naprawianiem genów mierzy się na co dzień, pojawił się wpis wyliczający pierwsze wątpliwości – Knoepflera, ale także kilku innych prominentnych badaczy, których projekty w dużej mierzy opierają się na genetycznie modyfikowanych myszach.

Jedną z pierwszych rzeczy, na którą krytycy zwrócili uwagę, był sposób dostarczenia elementów systemu CRISPR/Cas9 do mysich zarodków. Enzym Cas9 można bowiem dostarczyć komórkom na wiele sposobów: można sekwencję kodującą enzym wbudować do genomu docelowego tak, aby komórki same sobie potem produkowały ten enzym. Można go też wprowadzić w formie białka. Ta druga opcja jest obecnie preferowana, ponieważ forma białkowa jest po krótki czasie usuwana przez komórki, co ogranicza jej działanie. Jeśli enzym jest przez komórkę produkowany cały czas, to jego aktywność w komórce nie będzie malała i szansa na to, że enzym potnie nie to, co powinien, będzie się z czasem tylko zwiększać. Wygląda jednak na to, że autorzy pracy w Nature Methods zdecydowali się zastosować tę mniej lubianą metodę.

Kolejnym problemem, na którym skoncentrowali się komentatorzy, był brak porównania genomu myszy do genomów rodzicielskich, aby sprawdzić, czy wykryte mutacje nie istniały aby czasem jeszcze przed zastosowaniem CRISPR/Cas9. Nie omieszkano też wytknąć autorom, że próba dwóch myszy jest prawdopodobnie za mała, żeby móc cokolwiek stwierdzić z przyzwoitem stopniem pewności.

Na początku roku pisałem o tym, że środowisko naukowe biologów zaczyna doceniać znaczenie preprintów (prac udostępnionych publicznie przed oficjalną publikacją w periodyku fachowym). Dyskusja, która rozpętała się w tym przypadku, jest znakomitym przykładem tego, jak ważne jest udostępnianie wyników wcześnie i jak szybko – w porównaniu z tradycyjnymi drogami publikacji – można bubla zidentyfikować jako bubla2.

Na przełomie czerwca i lipca (przypominam, oryginalna publikacja – 30 maja) na serwerze biologicznych preprintów bioRxiv pojawiły się co najmniej trzy prace krytykujące oryginalny artykuł. Od razu widać, że rękawicy nie złożyły firmy „pokrzywdzone” przez medialne doniesienia.

Pierwszy preprint został opublikowany przez autorów związanych z Editas Medicine – i wymienia następujące bolączki w oryginale: mała próba (dwie myszy), mysz kontrolna niepochodząca z tego samego miotu (czyli mająca innych rodziców – czemu to jest ważne wyjaśniłem powyżej), sposób w jaki przeprowadzono sekwencjonowanie dla myszy redagowanych i myszy kontrolnej nie był taki sam (chodzi o tzw. głębokość sekwencjonowania; w skrócie chodzi o to, że mysz kontrolna została zsekwencjonowana w wersji lite, co może mieć bardzo duży wpływ na zdolność identyfikacji mutacji). Autorzy preprintu dokonali też powtórnej analizy oryginalnych danych, które dostępne są w publicznym repozytorium, i wykazali, że stopień podobieństwa między zredagowanymi myszami jest znacznie wyższy, niż by się można spodziewać, gdyby CRISPR/Cas9 rzeczywiście działał niespecyficznie. Z drugiej jednak strony, jest to dokładnie to, czego możnaby oczekiwać od myszy, które są ze sobą blisko spokrewnione, czyli mają te same mutacje odziedziczone od rodziców… Widzicie chyba, gdzie ten argument zmierza. Krytycy zwrócili uwagę jeszcze na kilka innych bolączek, w tym jedną redakcyjną: że to samo pismo zaledwie dwa lata wcześniej opublikowało znacznie lepiej zaprojektowane badanie, które wykazało coś zupełnie innego – że w myszach modyfikowanych za pomocą CRISPR/Cas9 mutacje poboczne występują bardzo rzadko. No i możnaby pomyśleć, że zaorane.

Ale nie. Następny preprint (ten, wygląda na to, niezwiązany z żadną z firm, chociaż w świecie CRISPR wszystko jest możliwe) pojawił się zaledwie tydzień później. Oczywiście wiele z krytycyzmów na tym etapie jest już wtórne, ale pojawiają się i nowe komentarze. Autorzy tej krytyki podkreślają niezwykłość jednego z wyników: to, że w oryginalnej pracy zidentyfikowano 12 razy więcej mutacji punktowych niż indeli. Ten aspekt jest zaskakujący, ponieważ wersja enzymu zastosowanego w tym badaniu bardzo rzadko produkuje mutacje punktowe, nawet – podkreślają autorzy preprintu – w miejscach, w których enzym ten ciąć według planu powinien. Czyli znowu: bardziej prawdopodobne wydaje się to, że zredagowane myszy miały tak wiele wspólnych mutacji punktowych, bo były spokrewnione znacznie bliżej niż mysz kontrolna.

Kolejny tydzień, kolejny preprint3 (ten znowu z firmy), kolejna powtórna analiza danych i kolejny argument, którego wcześniej nikt nie przedyskutował: jeśli gazylion nowych mutacji powstało na skutek działania enzymu Cas9, to należałoby wysunąć chociaż hipotezę na temat tego, w jaki sposób do tego doszło. W jaki sposób działa Cas9 wiemy bowiem dość dobrze. Wiemy na przykład, że enzym nie ma tendencji do cięcia wszystkiego, jak leci, co zresztą znowuż ma pewnie korzenie w tym, w jakim celu wyewoluował on u bakterii. Nie jest zatem jasne, w jaki sposób miałby on dokonać opisanego przez autorów oryginalnej prac spustoszenia. I jest to zarzut niebłahy. Zastosujmy tutaj bowiem brzytwę Occama: co brzmi prościej? Że myszy miały te same mutacje, bo były spokrewnione? Czy to, że dobrze opisany enzym, którego mechanizm działania znakomicie rozumiemy, zachował się w sposób całkowicie nieprzewidywalne i niezgodny z wszystkim, co o nim wiemy?

Autorzy oryginału nie pozostali jednak dłużni – na pierwszy preprint odpowiedzieli ogniem. W mało subtelny sposób umieścili na pierwszej stronie orzeczenie, że nie mają żadnych związków z firmami próbującychmi skomercjalizować CRISPR/Cas9 – uczynili to czcionką dwa razy większą od reszty tekstu (że niby inaczej nikt by tego nie zauważył). Nie jest jednak tak, że ktokolwiek tutaj te związki ukrywał. A zarzuty stawiane autorom były raczej od początku do końca merytoryczne.

Odpowiedź autorów jest jednak także dość merytoryczna. Mutacje, które zidentyfikowali, są być może niespecyficzne, ale często występują w rejonach, w których istnieje też tzw. sekwencja PAM (trójnukleotydowa sekwencja potrzebna to tego, aby enzym Cas9 mógł w ogóle wziąć się za rozpoznawanie sekwencji komplementarnej do sgRNA). Mysz kontrolna może nie była z tego samego miotu, ale była z tego samego szczepu i kolonii. Sekwencjonowanie genomu być może nie było równorzędne, ale ta wspomniana przeze mnie głębokość sekwencjonowania była już porównywalne w rejonach, w których znajdowały się mutacje. Problem z rozmiarem próby jest endemiczny – w oryginalnym eksperymencie redagowania genomu do skutecznej redakcji docelowego genu doszło tylko w dwóch zarodkach. Autorzy na wszystko zdają się mieć odpowiedź, zarzucając też krytykom, że wyniki powtórnych analiz nie zostały zweryfikowane eksperymentalnie (sami dostarczają takiej weryfikacji za pomocą sekwencjonowania Sangera – jednak tylko dla tuzina może przypadków), aczkolwiek należy pamiętać, że autorzy oryginału są jedynymi badaczami posiądającymi oryginalne próbki.

Periodyk wymianę ciosów śledził pilnie. Pod koniec lipca pojawiło się addendum to publikacji: tzw. Editorial Expression of Concern, czyli nota redakcyjna informująca czytelników o dyskusji wokół pracy, która rzuca dłuuugi cień na jej wnioski. Autorzy oryginału nie zgodzili się (nie całkiem o dziwo) z decyzją o publikacji noty redakcyjnej.

Z metodologicznego punktu widzenia najsłabszym aspektem oryginalnej pracy wydaje się być zastosowanie jako kontroli myszy niespokrewnionej z myszami zredagowanymi. Jest to też element, który, jeśli ma się na to środki, najłatwiej poprawić i przetestować. Co też uczynili badacze z Instytutu Sangera pod Cambridge.

Do redakcji wybrali inny gen, który odpowiada za umaszczenie myszy (więc o tym, że redakcja zaszła pomyślnie, świadczy od razu futrzany fenotyp). Przeprowadzili też serię eksperymentów kontrolnych – takich, gdzie do embrionów wstrzykiwany był tylko sam enzym, albo sama sekwencja naprowadzająca. Wszystkie myszy – zarówno potomstwo jak i rodzice – zostały zsekwencjonowane na dziesiątą stronę.

adams fig 1
Projekt doświadczenia: rodzaje kontroli zastosowanych przez badaczy z Instytutu Sangera oraz wykres pokazujący przebieg analizy bioinformatycznej – oraz same wyniki. /Iyer et al. (CC By)

Okazuje się, że jeśli uwzględni się ten efekt rodzicielski, to u potomstwa występuje średnio nieco ponad tuzin mutacji punktowych i może jeden indel. A różnice pomiędzy różnymi potomkami są w zasadzie zaniedbywalne. No i może nie unieważnia ten wynik bezpośrednio pracy w Nature Methods, bo jest próbą replikacji, czy nawet – biorąc pod uwagę inny szczep, inny gen, itd. – pseudoreplikacji. Ale wpisuje się on mocno do kanonu literatury, która sumarycznie wskazuje jednak raczej na to, że Cas9 mutacje poboczne rzeczywiście wywołuje bardzo rzadko (a warto zdawać sobie sprawę, że ludzie nabywają spontanicznie z pokolenia na pokolenie więcej mutacji, niż zaobserwowano w tym badaniu, które przecież polegało na celowym mutowaniu zwierząt).

Pismo podjęło w końcu decyzję: oryginalny artykuł został wycofany w zeszły piątek. Tego samego dnia Nature Methods opublikowało też oficjalne, zrecenzowane wersje zeszłorocznych preprintów (a także jeden List do Redakcji, który chyba preprintu nie miał, chociaż nie jestem na 100% pewien). Powodem retrakcji ma być to, że nie da się poza wszelką wątpliwość wykazać, że zaobserwowane mutacje były skutkiem działania CRISPR/Cas9. Problemem okazuje się też to, że sposób w jaki autorzy pozyskali myszy do badania: drogą kupna zarodków, co oznacza, że nie mieli dostępu do materiału biologicznego od zwierząt rodzicielskich – nie mogli więc zsekwencjonować ich DNA, aby potwierdzić raz na zawsze, czy mutacje zostały wywołane przez CRISPR/Cas9, czy też były w zarodkach od początku. Redakcja wziąwszy te wszystkie argumenty pod uwagę uznała, że poprawność pracy stoi pod znakiem zapytania na tyle dużym, że publikację należy oficjalnie usunąć z literatury fachowej. Biorąc pod uwagę opór autorów przeciw krytyce od momentu publikacji nie jest raczej zaskoczeniem, że się z tą retrakcją nie zgodzili4.

Próbując natomiast – na to przynajmniej wygląda – ubiec tę retrakcję, na początku zeszłego tygodnia autorzy oryginału opublikowali na bioRxiv jeszcze jeden preprint zatytułowany „Korekta i ciąg dalszy: sekwencjonowanie pełnego genomu w wielu liniach myszy redagowanych za pomocą CRISPR/Cas9 sugeruje, że nie ma nadmiaru mutacji”. Tytuł zdaje się sugerować, że autorzy poddali się i przyznają rację, że CRISPR/Cas9 nie powoduje mutacji pobocznych.

Nie jest to jednak wcale oczywiste już z samego abstraktu. W tym ciągu dalszym badania autorzy bowiem zbadali inne szczepy myszy – i inny gen – i wciąż twierdzą, że liczba obserwowanych mutacji pobocznych jest znaczna (chociaż możliwe, że tylko w szczególnych przypadkach). Co ciekawe jednak, także w tych badaniach autorzy posłużyli się tym samym planem badawczym: także w tym przypadku, dla żadnego z badanych przykładów, nie posiadali materiału pochodzącego od rodziców.

I trudno oprzeć się wrażeniu, że ta korekta to łabędzi śpiew autorów oryginalnej pracy. Podejrzewać też można, że Editas, Intellia, i inne firmy pracujące nad komercjalizacją CRISPR/Cas9 oryginalną publikacją już dawno przestały się przejmować, skupiając uwagę raczej na robieniu tego, co robiły już wówczas, gdy Nature Methods słało wartość ich akcji w kubeł – na szukaniu wersji i wariantów tej techniki, dla której specyficzność enzymu Cas9 nie będzie problemem i pozwoli na terapeutyczne zastosowanie redagowania genomu.

Dysklejmer:

Autor bloga pracuje w wydawnictwie wydającym Nature Methods (Springer Nature). Dostępu do żadnych insajderskich informacji jednak nie miał (a jakby miał, to by o tym kazusie nie pisał).

Przypisy:

1. Zdaję sobie sprawę, że retrakcja NgAgo nastąpiła po publikacji w Nature Methods, jednak afera NgAgo ciąnęła się już wówczas od ponad roku i to w bardzo publiczny sposób, więc nie jest tak, że ostrzeżeniem była dopiero retrakcja. Raczej należałoby powiedzieć, że retrakcja była tylko długo oczekiwaną puentą.

2. Tu muszę zaznaczyć, że to nie jest krytyka kolegów i koleżanek z Nature Methods – proces redakcyjny prowadzący do formalnej korekty publikacji jest nieco bardziej skomplikowany niż się może wydawać. Nie wystarczy, że ktoś krzyknie j’accuse: każda krytyka opublikowanej pracy sama też musi przejść proces recenzji, który łatwy czy szybki nie jest. A często rozchodzi się nie o to, co w samej pracy się znajduje jako wynik, ale o jedno słowo interpretacji – albo wręcz o kompletne niezrozumienie publikacji przez laickie massmedia…

3. W zasadzie ten preprint nie był kolejny – dzień wcześniej ukazała się jeszcze jedna powtórna analiza napisana przez grupę badaczy z MIT i Harvardu, którzy także mają powiązania z przemysłem. Ta analiza jednak powtarza tylko już opisane argumenty, więc nie chciałem więcej przynudzać.

4. Retrakcja publikacji z literatury jest nie tylko obwieszczeniem redakcji: jest też formalnym i technicznym procesem, który musi przebiegać według określonych reguł i wymogów. Jednym z tych wymogów jest podanie informacji, czy autorzy zgodzili się z retrakcją (wszyscy lub tylko część z nich).

Reklamy

1 Comment

Skomentuj

Wprowadź swoje dane lub kliknij jedną z tych ikon, aby się zalogować:

Logo WordPress.com

Komentujesz korzystając z konta WordPress.com. Wyloguj /  Zmień )

Zdjęcie na Google+

Komentujesz korzystając z konta Google+. Wyloguj /  Zmień )

Zdjęcie z Twittera

Komentujesz korzystając z konta Twitter. Wyloguj /  Zmień )

Zdjęcie na Facebooku

Komentujesz korzystając z konta Facebook. Wyloguj /  Zmień )

w

Connecting to %s