„BUM!”, czyli Nobel z chemii za potężne receptory

Znowu nie udało się Karolowi Matyjaszewskiemu, George’owi Whitesidesowi, Richardowi Zare. Nie dostał nagrody Louis Brus za kwantowe kropki, Hutchings z Harutą za zastosowanie złota jako katalizatora, ani Fujishima za fotokatalizę z użyciem dwutlenku tytanu – a to dopiero byłaby zasłużona nagroda!

Nie; podobnie jak 5 innych razy w ostatniej dekadzie Nagrodę Nobla z chemii w 2012 roku przyznano za odkrycia z zakresu biochemii. Jak wielu chemików jestem trochę rozczarowany. To powiedziawszy dodać muszę od razu, że za te akurat badania nagroda od dawna była zasłużona.

Dokonajmy zatem formalności: Laureatami Nagrody Nobla z dziedziny chemii za rok 2012 zostali dwaj Amerykanie Brian Kobilka oraz Robert Lefkowitz „za ich badania nad receptorami sprzężonymi z białkami G”.

Tajemnicza komunikacja

Receptory sprzężone z białkami G – tzw. GPCRs (ang. G protein coupled receptors) – to rodzina białek siedzących w błonach komórkowych i odpowiedzialnych za komórek kontakt ze światem. Dosłownie, bowiem jako receptory sygnałów pozakomórkowych GPCRs są niesamowicie wszechstronne: reagują z ligandami (cząsteczkami wiążącymi się z nimi) tak małymi jak adrenalina, dopamina i serotonina, poprzez średniego rozmiaru leki, aż po olbrzymie białka.

Klasycznym przykładem działania GPCR jest właśnie adrenalina, ponieważ od niej zaczyna się historia odkrycia i opisania receptorów sprzężonych z białkami G. Kiedy po raz pierwszy wyizolowano adrenalinę¹, szybko zaczęto badać jej wpływ na żywe organizmy. Wkrótce odkryto jej działanie na tętno i ciśnienie krwi oraz na rozmiar źrenic. Na początku XX wieku badacze podejrzewali jednak, że adrenalina działa na system nerwowy. Okazało się jednak, że jej efekty były wciąż widoczne nawet po sparaliżowaniu zwierząt laboratoryjnych². Wnioski były następujące: komórki muszą posiadać jakiś rodzaj mechanizmu, który pozwala im wykryć substancje chemiczne w otoczeniu. Ergo – receptory.

Przez lata jednak nie rozumiano, czym te receptory miałyby być, jaka powinna być ich struktura, aby umożliwić wewnątrz komórki reakcją na bodziec znajdujący się poza nią. W latach 1940. Amerykanin Raymond Ahlquist prowadził badania, które pozwoliły mu zidentyfikować dwa rodzaje receptorów reagujących z adrenaliną, które nazwał receptorami alfa i beta (-adrenergicznymi). Ahlquist wciąż jednak nie wiedział, czym – w sensie chemicznym – są receptory. Prawdopodobnie właśnie to nieco abstrakcyjne podejście do konceptu receptorów, a także brak wystarczających danych doświadczalnych i ogólne niezrozumienie idei receptora w owym czasie były powodem tego, że Ahlquist miał olbrzymie problemy z publikacją swojej pracy, a gdy w końcu mu się to udało – tylko dzięki przyjaźni z redaktorem naczelnym pisma – praca była zupełnie zignorowana i zapomniana przez kolejne pół dekady zanim doceniono jej znaczenie³.

„Krzyk” Muncha – prezentacja nagrody rozpoczęła się od próby wystraszenia widowni przez jednego z jurorów okrzykiem „BUM!”, po którym nastąpiło wytłumaczenie, jak działa adrenalina, oraz opowieść o jej roli w odkryciu receptorów GPCR. /źródło: wiki commons

Główną zasługą Ahlquista było – jak on sam mówi – spopularyzowanie na nowo nieco zapomnianego konceptu receptorów. Prawdziwe zmiany przyszły jednak prawie dwie dekady później, gdy za badania nad receptorami zabrał się Robert Lefkowitz.

Receptory 101

Gdy Robert Lefkowitz⁴ zaczynał pracę na receptorami w późnych latach 60., cała ta dziedzina biologii była jeszcze w głębokich powijakach. Znane były co prawda niektóre z elementów całego tego systemu sygnalizacji: Earl Sutherland opisał działanie enzymu cyklazy adenylowej i jej oddziaływania z cyklicznym AMP – małą cząsteczką działającą w komórkach jako wtórny przekaźnik. Za te badania otrzymał zresztą także Nagrodę Nobla z fizjologii i medycyny w 1971r. Za opisanie innego enzymu, cAMP-zależnej kinazy białkowej odpowiedzialnej za syntezę cAMP, oraz za opisanie białek G tą samą nagrodę otrzymali 23 lata później Martin Rodbell oraz Alfred Gillman. Pomimo ogromu badań biochemicznych i fizjologicznych na receptorach, pomimo tego, że w latach 60. zaczęto stosować leki oparte na teorii receptorów alfa i beta-adrenergicznych, wciąż jednak nie wiadomo było, co dokładnie wiąże ligandy i przekazuje sygnał do wnętrz komórki. Nieznana była fizyczna forma receptorów, a niektórzy wątpili nawet, czy receptory są rzeczywiście niezależnymi cząsteczkami⁵.

Niezwykle ważną metodą badania receptorów okazało się zastosowanie znakowanych radioaktywnie ligandów. I Lefkowitz odniósł sukces tam, gdzie inni zawiedli: udało mu się zmodyfikować hormon adrenokortykotropowy (ACTH) dołączając do niego radioaktywny jod, a następnie zaobserwować wiązanie się tego hormonu do wyizolowanej błony komórek nadnercza. Co więcej, gdy oznakowany ligand związany był już z receptorem, można było wówczas śledzić jego ruch tego receptora obrębie błony komórkowej. Po tym sukcesie z receptorem adrenergicznym, Lefkowitz zaczął pracować nad receptorem adrenaliny.

Jednym z problemów związanych z obserwacją i badaniami tych receptorów była ich względna rzadkość: po pierwsze, trudno je było znaleźć w błonie komórkowej. Po drugie zaś, nieznane były źródła w nie bogate, nie było też metody oczyszczania receptora tak, aby móc prowadzić na nim dalsze badania in vitro. Jednym z dużych sukcesów Lefkowitza⁶ było opracowanie wydajnej metody oczyszczania tego receptora. Początkowe wątpliwości, czy uzyskane białko jest w istocie funkcjonującym receptorem, zostały rozwiane, gdy udało się je zagnieździć w lipidowych pęcherzykach symulujących błonę komórkową i pokazać, że rzeczywiście działają.

W tym mniej więcej momencie na scenie pojawił się Brian Kobilka, potomek małomiasteczkowej rodziny piekarzy z Minnesoty. Kobilka we wczesnych latach 80. Rozpoczął staż podoktorski w grupie Lefkowitza, która w owym czasie miała już wyrobioną renomę jako lab specjalizujący się w receptorach, zwłaszcza adrenaliny. Lefkowitz rozważał właśnie podjęcie się nowego wyzwania: sklonowania genu receptora β₂-adrenergicznego i określenia jego sekwencji. Zadaniem tym obarczony został nowy pracownik labu – Kobilka.

Udało mu się to w ekspresowym tempie – w ciągu dwóch lat od rozpoczęcia pracy z Lefkowitzem w Nature pojawiła się publikacja opisująca sekwencję genu receptora. Analiza tej sekwencji pozwoliła na pewne ciekawe wnioski. Otóż okazało się, że w łańcuchu aminokwasowym tego białka znajduje się kilka sekwencji typowych dla białek siedzących w błonach komórkowych. Chodzi o sekwencje aminokwasów hydrofobowych – tych nie lubiących wody, a lubiących za to tłuszcze, czyli także lipidy, z których zbudowana jest błona komórkowa. Wyglądało zatem na to, że łańcuch aminokwasowy wije się w poprzek błony jak wąż, przechodząc to na jedną, to na drugą stronę.

Porównanie sekwencji receptora beta-adrenergicznego oraz rodopsyny. Kolorowe prostokąty to sekwencje kodujące aminokwasy znajdujące się w części błonowej białka. /źródło: materiały prasowe Komitetu Noblowskiego

W latach osiemdziesiątych innym już całkiem przyzwoicie opisanym receptorem była rodopsyna. Rodopsyna to receptor znajdujący się w oku, a reagujący na światło. Wiedziano o niej, że siedzi zagnieżdżona w błonie, że wije się w poprzek, i że aktywuje wewnątrz komórek białka G – te same które były aktywowane przez receptor β₂-adrenergiczny. Mimo tych podobieństw receptory dzieliła różnica wydawałoby się krytyczna: jeden był aktywowany przez światło, drugi przez hormony.

Lefkowitz wiele lat później powiedział, że to objawienie po odkryciu, jak podobna jest struktura badanego przez nich receptora i rodopsyny, to był prawdziwy moment olśnienia. Zrozumieli bowiem wówczas, że białka te należą do jednej i tej samej rodziny znanej dzisiaj jako receptory sprzężone z białkami G.

7 turbo baryłek

Receptory z rodziny GPCR zbudowane są więc z długiego łańcucha polipeptydowego, który błonę komórkową przecina siedmiokrotnie. Gdy z częścią receptora wystającą na zewnątrz komórki wiąże się ligand – hormon, lek, białko – receptor zmienia swój kształt (w rodopsynie wygląda to nieco inaczej – w jego wnętrzu znajduje się cząsteczka czuła na światło, która wymusza zmianą konformacji białka po zaabsorbowaniu fotonu). Zmiana kształtu powoduje, że jego część wyeksponowana do wnętrza komórki wiąże się z białkiem G, aktywując je. Białko G ulega wówczas rozpadowi na podjednostki. Jedna z nich, podjednostka α, uruchamia kaskadę sygnałową we wnętrzu komórki, a całe białko G odrywa się od receptora. Gdy przy receptorze robi się miejsce, łączy się z nim kolejne białko G, które ulega aktywacji, rozpadowi na podjednostki i… I resztę już znacie. Jeden receptor może przejść wiele takich cyklów, zanim opuści go związany z nim ligand.

Nie wiadomo dokładnie, jak duża jest rodzina białek GPCR. Znanych jest niemalże 800 ludzkich genów kodujących te białka – ale oczywiście nie oznacza to, że białek tych nie jest znacznie, znacznie więcej⁷. Jak powiedziałem jednak na wstępie, białka te odpowiedzialne są za kontakt komórek ze światem. Receptory należące do tej rodziny reagują na światło – wspomniana rodopsyna należy do całej klasy białek zwanych opsynami, występujących często i gęsto w siatkówce. Reagują też na bodźce węchowe: cała kolejna klasa receptorów znajduje się w nabłonku węchowym, a także w narządzie Jacobsona odpowiedzialnym za wyczuwanie i reakcję na feromony. Biorą udział w reakcjach obronnych organizmu poprzez reakcją z histaminą. Stąd też ich rola w alergiach. W mózgu receptory z tej rodziny biorą udział w przekazie sygnału niesionego przez takie neuroprzekaźniki jak dopamina i serotonina, czyli innymi słowy decydują o tym, w jakim humorze wstajemy rano z łóżka. No i oczywiście mają niemałą rolę w działaniu autonomicznego układu nerwowego, kontrolując automatyczne funkcje naszego organizmu takie jak ciśnienie krwi, czy (bardzo przyziemnie) procesy trawienia.

Przez to wszechstronne zaangażowanie w funkcjonowanie naszego organizmu białka GPCR stały się niezwykle popularnym celem leków. Właśnie w latach 60., zanim jeszcze zrozumiano, czym receptory w ogóle są, już na bazie reakcji z nimi działały β-blokery. Obecnie szacuje się, że oddziaływanie z receptorami GPCR jest zasadą działania blisko 40% leków!

Pomimo tego, że sekwencje tych genów zaczęto opisywać na początku lat 80., że wreszcie zrozumiano, że białka te stanowią jedną, bardzo liczną rodzinę, że coraz to i bardziej zaawansowane badania pozwalały nam zrozumieć coraz więcej na temat tych białek i wykorzystać je w nowych terapiach farmakologicznych; pomimo tego wszystkiego wciąż brakowało jednej rzeczy, kropki nad i, wisienki na torcie.

Otóż takim ostatecznym trofeum dla każdego badacza białka są dwie rzeczy – jego sekwencja DNA (dzisiaj odkrycie takiej to pikuś) oraz jego struktura krystaliczna. Opisanie struktury krystalicznej jest znacznie trudniejsze, bowiem wymaga skrystalizowania obiektu badania, a białka są w tej kwestii bardzo niewdzięczne. Po pierwsze, niechętnie w ogóle się krystalizują – często tworzą po prostu amorficzną masę, która do niczego się nie nadaje. Po drugie, struktura krystaliczna jest tylko stop klatką pokazującą zazwyczaj jedną z wielu możliwych form białka. W odróżnieniu od „wyrytej w kamieniu” sekwencji DNA, białko jest dynamiczne – zwija się i skręca, faluje, przemieszcza, zmienia kształt. Trudność polega zatem na złapaniu go w jednym z tych momentów, na uzyskaniu obrazu, które przedstawia jedną jego formę, a nie średnią pomiędzy wieloma stanami. Po trzecie zaś, ze wszystkich białek najtrudniejsze do skrystalizowania są właśnie białka błonowe.

W 2000 roku strukturę krystaliczną rodopsyny opublikował Krzysztof Palczewski (właśnie to osiągnięcie, za które niektórzy chętnie i jemu daliby Nobla). W zeszłym roku historia zatoczyła jednak piękne koło: w tygodniku Nature strukturę krystaliczną aktywnego receptora β₂-adrenergiczny opublikował Brian Kobilka. Z imponującą rozdzielczością 3.2Å, uzyskany obraz pokazuje nie tylko sam receptor, ale także związany z nim z jednej strony ligand, z drugiej natomiast – białko G. I chociaż opisanie tej struktury jest samo w sobie dla Kobilki niesamowitą nagrodą, jestem pewien, że w parze z noblowskim medalem smakuje jeszcze słodziej.

Struktura krystaliczna opisana w 2011 przez Kobilkę: na niebiesko zaznaczony jest receptor GPCR, na czerwono – białko G, na żółto zaś związany z receptorem hormon. /źródło: materiały prasowe Komitetu Noblowskiego

Przypisy:

1. Niewiele osób wie, że ekstrakt nadnerczy zawierający adrenalinę i inna katecholaminy został po raz pierwszy otrzymany przez polskiego fizjologa, Napoleona Cybulskiego.

2. Urok badań w zakresie biologii i fizjologii w pierwszej połowie XX wieku był taki, że to, co dzisiaj można by zrobić dopiero po wypełnieniu stosu formularzy i po zatwierdzeniu przez 10 komisji ds. etyki, wówczas można było zrobić od razu, z miejsca, bez zastanowienia i bez kontroli. Raymond Ahlquist, odkrywca receptorów adrenergicznych, wspomniał po latach na temat swoich badań prowadzonych w latach 40.: „Moja praca […] przypadła na ‘złoty wiek’ badań biomedycznych: brak techników, brak analiz statystycznych, leki o wątpliwym stopniu czystości, […] kimograf, tanie zwierzęta laboratoryjne i duża ilość zajęć dydaktycznych.” Czytając to każdy naukowiec powinien złapać się za głowę (a w duchu pewnie pomyśleć, że też by tak chciał/a).

3. Odbiła się od dna, gdy Ahlquist opisał jej zawartość w przygotowywanym przez siebie podręczniku. Do dzisiejszego dnia, blisko 65 lat od jej publikacji, pracę zacytowano ponad 3000 razy. To oczywiście nijak się ma do światowego rekordzisty (pracy Lowry’ego dotyczącej oznaczania białek, która jest najbardziej cytowaną publikacją świata z prawie 230 tysiącami cytacji!), ale powiedziałbym, że i tak jest na bardzo przyzwoitym poziomie.

4.Dla tych spośród z Was, którzy w Nagrodach Nobla doszukują się patriotycznie polskich akcentów mam taką wiadomość: rodzina Lefkowitza ma korzenie w Polsce, z której wyemigrowała pod koniec XIX wieku. To na otarcie łez dla tych z Was, którzy mieli już okazję przeczytać o tym, że nagroda – jak donosi Nature – ominęła Krzysztofa Palczewskiego.

5. Jeśli się nad tym dobrze zastanowić, jest coś niesamowitego w tym, że przez co najmniej kilka dekad w połowie XX wieku przemysł farmaceutyczny funkcjonował w oparciu o bliżej niezidentyfikowany abstrakcyjny koncept receptorów. Nie oznacza to oczywiście, że nauka była w lesie, o nie. Badacze zajmujący się tą tematyką zdecydowanie wiedzieli, że dzwoni, ale za Chiny ludowe nie potrafili powiedzieć, w którym kościele. Dzisiaj to wszystko wydaje nam się często oczywiste, bo nawet jeśli nie znamy się specjalnie na biochemii, wystarczy, że ktoś rzuci hasło: białko, błona, to i tamto, i coś nam zaczyna powoli świtać. Trudno jest nam więc czasem ogarnąć, jak olbrzymi postęp dokonał się w biochemii przez ostatnie pół wieku. Próba wytłumaczenia ludziom wówczas teorii, które dzisiaj uznajemy za oczywiste, byłaby jak próba wytłumaczenia komuś pod koniec lat 80., co to jest email albo telefon komórkowy.

6. Opracowanie metody oczyszczania jest niestety mało seksownym osiągnięciem naukowym – nie zdarzyło mi się chyba widzieć nikogo podnieconego możliwością pozyskania niemalże perfekcyjnie oczyszczonego białka z próbki zawierającej je w ilości 1 cząsteczki na 100 tysięcy, kto nie byłby chemikiem analitykiem. Ja poniekąd jestem, więc się podniecam.

7. Jak wiedzieć będą uważne czytaczki i pilni czytacze pamiętający mój wpis o alternatywnym splicingu.

8. Historical review: A brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors (2004), Robert Lefkowitz, Trends Pharmacol Sci 25(8):413

9. Cell signalling: It’s all about the structure (2011), Lizzie Buchen, Nature 476: 387; doi:10.1038/476387a

10. Cell-signalling work nets chemistry Nobel (2012), Richard Van Noorden, Nature; doi:10.1038/nature.2012.11557