Od wczesnych lat siedemdziesiątych do sekwencjonowania stosowano opisaną przeze mnie kilka miesięcy temu metodę Sangera. Metoda ta, choć niesamowita w swojej prostocie, miała oczywiście liczne ograniczenia – największe z nich to koszt i skala, na jaką stosować można było tę technikę. Dlatego nic dziwnego, że wciąż poszukiwano alternatyw i ulepszeń. Poszukiwania te zrodziły takie technologie jak sekwencjonowanie przez hybrydyzację i sekwencjonowanie przez ligację1, a także pirosekwencjonowanie. Pirosekwencjonowanie zostało opisane po raz pierwszy przez dwóch badaczy z jednej ze sztokholmskich uczelni w połowie lat dziewięćdziesiątych XX w.
Pirosekwencjonowanie nazywane jest także sekwencjonowaniem przez syntezę. Jak może pamiętacie, sekwencjonowanie Sangera także odbywa się poprzez syntezę nici DNA komplementarnej do nici, której sekwencję chcemy poznać. W trakcie syntezy do mieszanki dodaje się zmodyfikowane nukleotydy, które losowo blokują reakcję syntezy, tworząc całą gamę różnej długości kawałków DNA pokrywających się w mniejszym lub większym stopniu z sekwencją szukaną. Te odcinki rozdziela się potem na żelu, a z tego, jakim nukleotydem kończy się każdy z nich, wnioskować można o sekwencji całego kawałka. Jak widać, metoda jest bardzo pracochłonna. Pirosekwencjonowanie sytuację upraszcza w dużym stopniu: pozwala bowiem wykrywać w czasie rzeczywistym, jaki nukleotyd dodawany jest do sekwencji.
Sekwencjonowanie zaczyna się podobnie jak metoda Sangera: od pojedynczej nici DNA, której strukturę pierwszorzędową chcemy poznać, primera, kilku enzymów i mnóstwa cegiełek. Nić DNA, od której zaczyna się zabawa, jest trwale związana ze stałym substratem, tak aby pozostać w tym samym miejscu podczas wielu etapów przemywania substratu. Do mieszanki dodaje się primer.
Aby rozpoznać kolejny nukleotyd w sekwencji, substrat przemywa się kolejno czterema mieszaninami. Każda z nich zawiera jeden rodzaj nukleotydu: dATP, dTTP, dCTP lub dGTP, a także kilka enzymów oraz adenozyno-5’-fosfosiarczan (APS) i lucyferynę. Gdy mieszanina zawiera właściwy – czyt. komplementarny do kolejnego w kolejce – nukleotyd, polimeraza dodaje kolejną cegiełkę do nici DNA, a w procesie tym uwalniana jest reszta fosforanowa. Gdy do tego dochodzi, do akcji włączają się pozostałe enzymy obecne w mieszaninie uruchamiając kaskadę, która prowadzi do emisji światła. Fosforan reaguje z APS przy udziale sulfurylazy ATP uwalniając siarczan i właśnie ATP. Następnie ATP reaguje z tlenem i lucyferyną pod wpływem lucyferazy i dają kilka kolejnych produktów, z których najważniejszym jest wyemitowany foton. Obecna w mieszaninie apyraza odpowiada za rozkład nieprzereagowanych nukleotydów i ATP.
Czyli: dodatek jednego nukleotydu do nowej nici to cykl czterech przemyć substratu różnymi mieszaninami. O tym, co się dzieje na substracie, informuje nas prosty pomiar emitowanego światła. Standardowy wynik wygląda tak:
Procedurę syntezy powtarza się aż do upadłego. Ale oczywiście istnieją praktyczne jej ograniczenia. Po pierwsze, podczas gdy metoda Sangera nadaje się do sekwencjonowania fragmentów nie dłuższych niż 800-1000 nukleotydów na raz, pirosekwencjonowanie nadaje się do odcinków jeszcze krótszych, o długości 300-500 nukleotydów. Szczególne problemy pirosekwencjonowanie ma z tzw. homopolimerami, czyli odcinkami, na których występuje wiele takich samych nukleotydów pod rząd2. Niemniej jednak metoda jest znacznie szybsza od metody Sangera. Jeszcze kilka lat temu, w okolicach roku 2005-2006, pirosekwencjonowanie było główną metodą stosowaną do sekwencjonowania genomów de novo. Z nastaniem ery sekwencjonowania nowej generacji (ang. next generation sequencing), pirosekwencjonowanie odeszło nieco w cień. Bardzo często stosuje się je jednak w celu potwierdzenia wyników sekwencjonowania uzyskanych innymi metodami lub do tzw. re-sekwencjonowania – sekwencjonowania genomów, które już zostały opisane, w celu potwierdzenia szczegółów i lepszego ich opisania. Inne zastosowania pirosekwencjonowania to genotypowania polimorfizmów pojedynczych nukleotydów, wykrywania mutacji i analizy metylowanego DNA.
Przypisy:
1. Których nie będę tutaj w detalach opisywał, ale być może kiedyś w przyszłości krótko do nich powrócę.
2. Tu trzeba jednak oddać pirosekwencjonowaniu sprawiedliwość: większość metod sekwencjonowania z homopolimerami się nie lubi.
3. Mostafa Ronaghi (2001). Pyrosequencing Sheds Light on DNA Sequencing Genome Research, 11, 3-11 : 10.1101/gr.150601
4. Chowdhury, F., & Chowdhury, A. (2012). Pyrosequencing-An Alternative to Traditional Sanger Sequencing American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 8 (1), 14-20 DOI: 10.3844/ajbbsp.2012.14.20
nic prostszego 