Powtarzane w mediach doniesienia o próbach rekonstrukcji dłoni Roberta Kubicy przypominają nam o tym, jak istotnym elementem mechanizmu, jakim jest organizm, są nerwy. W przypadku Kubicy lekarze koncentrowali się na nerwach (między innymi, o czym wielu dziennikarzy zapomina, a o czym przypomina Przemysław Iwańczyk – w końcu nie nerwy były tu najważniejsze). W przypadku większości operacji chirurgicznych jednak, nerw są tylko elementem, wokół którego trzeba pracować, dłubać, ciąć i zszywać. I to tak, aby go nie uszkodzić.
A sprawa nie jest błaha, bo przypadkowe nawet przecięcie czy uszkodzenie nerwu może prowadzić – w zależności od tego, o jakim nerwie mówimy – do całej gamy objawów, zaczynając od odrętwienia, a na paraliżu kończąc. W trakcie operacji nerwy rozpoznaje się po ich wyglądzie oraz położeniu względem pozostałych części ciała. Mniejsze i cieńsze włókna łatwo jednak przeoczyć lub błędnie rozpoznać. Nie wspominająco przypadku, gdy to właśnie włókno nerwowe jest obiektem ataku raka – wówczas operacja staje się spacerem po polu minowym.
Rozwiązanie tego problemu zaproponowała właśnie grupa badaczy z Kalifornii. Wyniki ich badań zostały opublikowane na dniach w Nature Biotechnology.
Nie to, żeby jakieś rozwiązania już nie istniały – w dzisiejszej neurochirurgii stosuje się zastrzyki barwników fluorescencyjnych. Metoda ta ma jednak wiele ograniczeń wynikających po pierwsze z tempa transportu tych barwników wewnątrz nerwów, a po drugie z zanieczyszczenia miejsca, w których dokonuje się wstrzyknięcia, nadmiarem barwnika. Idealnym rozwiązaniem byłoby więc znalezienie takiego barwnika, który można łatwiej wprowadzić do organizmu, który będzie łatwiej poprzez nerwy podróżował (bo np. będzie transportowany aktywnie, a nie po prostu przez dyfuzję), który będzie specyficznie wiązał się w nerwach – a najchętniej tych ich częściach, które są najdelikatniejsze i najtrudniejsze do zauważenia, jak np. liczne nerwy obwodowe.
Amerykanie zastosowali metodę o dźwięcznej nazwie phage display (polska nazwa to fagowa ekspozycja peptydów – ale szczerze mówiąc, wolę oryginalną nazwę), aby znaleźć peptydy, które w sposób wybiórczy wiązałyby się do neuronów. W metodzie tej stosuje się rodzaj wirusów zwanych bakteriofagami – lub w skrócie fagami – do DNA których wbudowywany jest fragment DNA kodujący białko bądź peptyd. Dzięki temu na powierzchni kapsydu (płaszcza ochronnego) faga pojawia się właśnie to białko bądź peptyd.
Jeśli więc mamy jakieś białko i próbujemy znaleźć inne białko bądź peptyd, które z tym białkiem oddziałują, postępowanie jest następujące: białko, które nas interesuje, przyłączamy do podłoża, a potem przepłukujemy je mieszaniną fagów z mnóstwem różnych białek/peptydów wyeksponowanych na ich kapsydach. Potem wypłukujemy niepotrzebne śmieci i na powierzchni powinno zostać nasze białka ze związanym do niego fagiem. Szybka analiza tego faga pozwoli nam ustalić, jakież to białko bądź peptyd wiąże się do naszego białka.
Badacze zastosowali tę metodę na fragmentach nerwów obwodowych gryzoni oraz na oczyszczonym zasadowym białku mielinowym (ang. myelin basic protein, MBP).
Uzyskane 4 potencjalne sekwencje (N38, N40, 41 i 42) zsyntetyzowano dodałączając do grup aminowych reszt lizynowych fluorescencyjny tag: fluoresceinę. Następnie każdy z tych peptydów został podany dożylnie żywym myszom. Kontrast pomiędzy nerwami a mięśniami był oceniany po ok. 2-4 godzin po zastrzyku. Im wyższy kontrast – tym więcej peptydu z fluoresceiną w nerwach, a co za tym idzie, wyższa specyficzność względem tej tkanki… Najlepsze wyniki, jak widać w tabeli powyżej, uzyskano dla peptydu oznaczonego jako NP41. Dla niego to przeprowadzono następnie bardziej szczegółowe badanie tkanek myszy i odkryto, że wszystkie nerwy obwodowe wraz z ich rozgałęzieniami (aż do włókien mających zaledwie 50 mikronów średnicy) dawały bardzo wyraźny sygnał pochodzący z fluorescencyjnego barwnika.
Badacze następnie sprawdzili, jak długo peptyd utrzymuje się w nerwach. Jeszcze przed wstrzyknięciem peptydu istnieje pewien maleńki kontrast między nerwami a mięśniami. W ciągu zaledwie sekund od zastrzyku naukowcy mogli zaobserwować peptyd podróżujący wzdłuż kapilar doprowadzających krew do nerwów. Intensywność w samych nerwach dochodziła do maksimum po 10 minutach od podania peptydu. Kontrast na poziomie, nazwijmy to, użytkowym, pojawiał się po ok. dwóch godzinach od zastrzyku utrzymywał przez kolejnych kilka godzin. W ciągu 24 godzin po peptydzie nie było zaś ani śladu.
Naukowcy postanowili też określić, do czego dokładnie w nerwach wiąże się NP41. W tym celu wstrzyknęli peptyd myszy transgenicznej, w której aksonach produkowane było fluorescencyjne białko YFP (mało oryginalna angielska nazwa: yellow fluorescent protein). Aby uniknąć nakładania się sygnału od YFP i fluoresceiny, zmieniono tag na peptydzie na czerwony barwnik Cy5.
Istotnym elementem badań było stwierdzenie, jak znakowany peptyd wpływa na zdrowie myszy. A takiego efektu nie stwierdzono, co rokuje bardzo pozytywnie, jeśli chodzi o dalsze badania na zwierzętach oraz, w nieco odleglejszej przyszłości, na pacjentach. Szybki metabolizm i usuwanie peptydu oznacza więc brak znaczących efektów ubocznych. Technika zatem wydaje się być bardzo obiecująca, zwłaszcza w świetle pierwszych testów na ludzkich nerwach (pochodzących od pacjentów poddanych laryngektomii), które wypadły bardzo dobrze.
Należy jednak pamiętać, że, jak każda metoda, także ta ma swoje ograniczenia. Podstawowym zaś ograniczeniem jest fakt, że peptyd do nerwów transportowany jest we krwi, co oznacza, że w przypadku urazów, które odcinają dopływ krwi do nerwów, zastosowanie tego peptydu staje się bezprzedmiotowe. Jest to jednak problem, który dotyczy większości (o ile nie wszystkich) wstrzykiwanych kontrastów, a znalezienie rozwiązania dla tego problemu będzie kiedyś odkryciem, które autorowi przyniesie wieczną sławę, chwałę, Nobla i zapewne bogactwo. Więc do roboty!
Whitney, M., Crisp, J., Nguyen, L., Friedman, B., Gross, L., Steinbach, P., Tsien, R., & Nguyen, Q. (2011). Fluorescent peptides highlight peripheral nerves during surgery in mice Nature Biotechnology DOI: 10.1038/nbt.1764
nic prostszego 