Genetyczny wymiatacz gatunków

Natura pełna jest samolubnych genów istniejących niejako na pograniczu gatunku – genów, które potrafią dobrać swoją pozycję w genomie organizmu w taki sposób, który służy tylko i wyłącznie ich dalszej, bardziej wydajnej propagacji. Do takich genów – które można też nazwać genetycznymi wirusami (zresztą historycznie większość tych sekwencji pochodzi własnie z wirusów w przeszłości zintegrowanych z naszym DNA) – należą na przykład transpozony, nazywane też skaczącymi genami. Innymi są geny naprowadzających endonukleaz (ang. homing endonuclease; HEG).

W 2003 roku biolog Austin Burt zaproponował (1), że takie samolubne geny, które potrafią specyficznie oddziaływać z określoną sekwencją DNA, mogą być wykorzystywane jako narzędzie inżynierii genetycznej do kontroli naturalnych populacji różnych organizmów.W tym celu zasugerował wykorzystanie właśnie genów HEG. Aby zrozumieć jak, ważne jest to, w jaki sposób geny te naturalnie rozprzestrzeniają się w populacji.

Wyobraźmy sobie, że osobnik posiada gen HEG na jednym z alleli w danym chromosomie (czyli jest heterozygotyczny względem tego genu. Innymi słowy, dzieci tego osobnika mają teoretycznie 50% szans na odziedziczenie genu HEG). Nukleaza HEG rozpoznają sekwencję o długości około 20-30 par zasad znajdujacą się na allelu nieposiadającym kopii genu. Następnie tnie DNA w tym miejscu, a naturalne systemy ratunkowe komórki przystępują od razu do naprawy nici. W trakcie tego procesu gen HEG zostaje wbudowany w środku oryginalnej sekwencji. To oznacza, że następnym razem kiedy HEG szuka miejsca do cięcia, nie przetnie on DNA w tym miejscu – co więcej, umieszczenie genu HEG wewnątrz sekwencji poszukiwanej przez nukleazę HEG oznacza, że sam gen HEG chroniony jest przed przypadkowym wycięciem. W ten sposób gen HEG rozprzestrzenia się w genomie. Zaś osobnik, który początkowo był heterozygotą, jest teraz homozygotą – to oznacza, że wszystkie jego dzieci prawie na pewno odziedziczą geny HEG. Mamy zatem ogólny mechanizm. W jaki jednak sposób Burt sugerował wykorzystnie tego zjawiska do manipulacji genetycznej?

Burt zaproponował zmodyfikowanie nukleazy HEG w taki sposób, aby rozpoznawała sekwencję znajdującą się w środku jakiegoś genu niezbędnego do funkcjonowania organizmu. Działając w sposób opisany wcześniej, nukleza wprowadziłaby własny gen do wnętrza tej sekwencji, osiągając tak dwojaki cel: po pierwsze zapewniając własne przetrwanie w tym miejscu w genomie, a po drugie efektywnie wyciszając gen, wewnątrz którego się wbudowała (ponieważ niemożliwa staje się poprawna jego transkrypcja). Warto zaznaczyć, że naturalnie występujące geny HEG nie atakują genów niezbędnych do przetrwania. Przyczyny są zapewne oczywiste – HEG atakujący takie geny po prostu sam by się z populacji wyeliminował.

Badacze do manipulacji powinni jako cel obrać taki gen, który po wyciszeniu daje niewielką zmianę w fenotypie heterozygoty (czyli gdy wyciszony jest tylko jeden allel), ale którego wyciszenie w obu allelach jest śmiertelne lub niemal śmiertelne. Ostatnim elementem strategii zaproponowanej przez Burta jest taka modyfikacja genu HEG, aby jego ekspresja kontrolowana była przez promotor aktywny tylko w trakcie mejotycznego podziału komórki – czyli podziału prowadzącego do powstania gamet. To rozwiązanie doprowadzi do sytuacji, w której heterozygoty rozwijać będą się w sposób normalny, ale HEG znajdzie się w znacznej proporcji ich komórek rozrodczych (czyli będzie miał prawie pewne szanse na pojawienie się w kolejnym pokoleniu). W ostatnim punkcie tej strategii pozwolić sobie można na pewną elastyczność – w zależności od sytuacji i genu będącego celem ataku, zastosować też można promotor specyficzny na przykład dla etapu larwalnego rozwoju lub promotor aktywny tylko w dorosłych komórkach somatycznych.

Gen tak wprowadzony do populacji w niewielkiej liczbie osobników początkowo rozprzestrzenia się w niej poprzez osobniki heterozygotyczne, aż osiągnie pewien poziom penetracji populacji (masę krytyczną, przy której większość osobników jest heterozygotycznymi nosicielami tego genu). W tym momencie dojdzie do sytuacji, w której nagle większość powstających zygot będzie homozygotyczne pod kątem niesprawnej wersji niezbędnego genu, a to, jak pamiętamy, bedzie dla tych zarodków miało skutek śmiertelny (lub ciężko kaleczący).

Wywód Burta zawiera sporo szczegółów na temat tego, jaka proporcja osobników populacji musi posiadać zmodyfikowany gen HEG, aby doprowadzić do takiego nagłego załamania, ile pokoleń zajmie dojście do punktu krytycznego, a także w jakich warunkach gatunek może obronić się przed takim atakiem poprzez rozwój naturalnej odporności na zmodyfikowany gen HEG. Dla nas jednak ważne jest to, jak to narzędzie można rzeczywiście wykorzystać do manipulacji genetycznej naturalnie występującej populacji jakiegoś gatunku, a także po co takiej manipulacji w ogóle dokonywać.

Burt w swojej pracy zaproponował jedną taką aplikację, o której dzisiaj mówi się bardzo dużo. A mianowicie zasugerował, że tę reakcję, która po angielsku nazywana jest gene drive (w języku polskim spotkałem się kiedyś z nazwą „mutageniczna reakcja łańcuchowa” – nie wiem, czy nazwa jest poprawna, ale dobrze oddaje charakter metody, więc będę ją tutaj dalej stosował), wykorzystać można na przykład do modyfikacji genu, który niezbędny jest komarom do przenoszenia zarodźca malarii. We względnie krótkim okresie (przynajmniej w skali życia komarów) możnaby doprowadzić do sytuacji, w której gen ten jest niemal całkowicie wyeliminowany z populacji uniemożliwiając zarodźcowi wykorzystywanie komarów do swoich niecnych celów.

Ten koncept w pracy Burta był czysto teoretyczny, jednak dzisiaj, ponad 15 lat od publikacji jego badań i 4 lata od opublikowania pierwszych prac pokazujących wykorzystanie potężnego systemu CRISPR/Cas do redagowania genomu (który umożliwia praktyczne wdrożenie koncepcji Burta), zastosowanie mutagenicznej łańcuchowej reakcji do kontroli populacji komarów jest jednym z najczęściej dyskutowanych potencjalnych zastosowań tej techniki.

Pierwsze kroki w tym kierunku już zostały poczynione. W 2014 roku grupa George’a Churcha opublikowała pracę, której pierwszym autorem był Kevin Esvelt (o tym młodym badaczu nieco więcej później). Ta publikacja w piśmie eLife omawiała dokładnie, w jaki sposób zastosować można właśnie CRISPR/Cas (2) do wywołania mutagenicznej reakcji łańcuchowej.

Zaś w zeszłym roku światło dzienne ujrzała praca badaczy z dwóch kalifornijskich uczeli. Pół dekady temu grupa Anthony’ego Jamesa pokazała, że komary Anopheles gambiae można genetycznie zmodyfikować w taki sposób, aby produkowały ludzkie przeciwciało przeciw zarodźcowi malarii, które efektywnie uniemożliwia pasożytowi wykorzystywania tego owada jako gospodarza. Wówczas jednak nie potrafili jeszcze doprowadzić do tego, aby gen ten nie tylko był przekazywany kolejnym pokoleniom, ale także aby jego dziedziczenie nie było losowe, aby było wydajne, i aby gen utrwalił się szybko w całej populacji. Z odsieczą przyszła technika CRISPR/Cas.

W marcu 2015 roku Ethan Bier i Valentino Gantz opublikowali przełomową – i kontrowersyjną – pracę w Science, w której po raz pierwszy zademonstrowali zastosowanie nowej technologii redagowania genomu do zapoczątkowania mutagenicznej reakcji łańcuchowej u muszek owocówek. W pracy opublikowanej w listopadzie w PNAS grupa Jamesa połączyła siły z Gantzem i Bierem, aby pokazać, że CRISPR/Cas może być wykorzystany do uruchomienia mutagenicznej reakcji łańcuchowej u komara Anopheles stephensi. W tej wersji reakcji genetyczny konstrukt przekazywany był do 99,5% osobników z kolejnego pokolenia i pozostawał aktywny – to oznacza, że skutecznie hamował infekcję pasożytem.

Po śladach Biera i Jamesa szybko podążyli inni (a być może nie tyle podążyli po śladach, co spóźnili się tylko odrobinę z własnymi publikacjami). Niecały miesiąc po publikacji w PNAS Nature Biotechnology opublikowało pracę, której autorem był między innymi Austin Burt, pokazującą zastosowanie mutagenicznej reakcji łańcuchowej u komara Anopheles gambiae w celu zmniejszenie płodności tego owada, co doprowadzić powinno do redukcji jego populacji w Afryce (jeśli gen zostałby wypuszczony z laboratorium do ekosystemu) i w ten sposób pomóc w walce z malarią.

W związku z przeciągającą się epidemią w 2016 roku media co kilka tygodni donosiły o innym potencjalnym zastosowaniu mutagenicznej reakcji łańcuchowej – do destrukcji komarów roznoszących wirusa Zika. Ogólnie rzecz biorąc, uwzględniając zademonstrowane już zastosowanie tej techniki w komarach, dojść można do wniosku, że całe pasożytniczo-infekcyjne zło tego świata, które w jakiś sposób do rozprzestrzeniania wykorzystuje komary, możnaby teraz wytępić jednym prostym pociągnięciem CRISPRowego ostrza.

Wielu badaczy jednak – w tym wspomniany przeze mnie Kevin Esvelt – uprzedza: nie tak szybko. Już w tej pierwszej teoretycznej pracy w eLife Esvelt wyjaśniał nie tylko, w jaki sposób teoretycznie wykorzystać można to narzędzie, ale także jakie niesie ono ze sobią zagrożenia, w jaki sposób można je kontrolować i regulować, jakie powinniśmy stosować środku zabezpieczające, aby upewnić się, że ta łańcuchowa reakcja nie rozszerzy się na przykład na pokrewne, niczemu nie winne, a być może ekologicznie lub rolniczo ważne gatunki. Podkreślił także, że przed pierwszym publicznym zastosowaniem tej techniki poza laboratorium ważny będzie publiczny dyskurs na jej temat: pod kątem etycznym, ale także pod kątem regulacji prawnych.

Ta praca opublikowana była w lecie 2014 roku. Chociaż w kwestii pojawia się coraz więcej głosów, regulacyjnie wciąż pozostajemy w lesie. Patrząc na prace Jamesa i Biera widać, że licho nie śpi – chociaż Esvelt też nie siedział bezczynnie: w tym samym czasie, gdy w Nature Biotechnology i PNAS publikowane były prace o zastosowaniu techniki do walki z malarią, Nature Biotechnology opublikowało też kolejną pracę Esvelta i Churcha, w której pokazali, w jaki sposób można kontrolować przebieg reakcji. Na przykład, stosując tę technikę na organizmach laboratoryjnych, które często są już w jakiś sposób genetycznie zmodyfikowane, jako docelową sekwencję atakowaną przez HEG obrać można syntetyczny gen obecny tylko w wersji laboratoryjnej organizmu, który nie występuje w populacjach dzikich.

Jeszcze w lecie 2015, przed jesiennymi publikacjami w PNAS oraz Nature Biotechnology, ale już w reakcji na pracę Biera i Gantza w Science, magazyn opublikował list podpisany przez 27 naukowców z całego świata zajmujących się (głównie, chociaż nie tylko) inżynierią genetyczną, nawołujący do odpowiedzialnego stosowania tej metody. Ironią losu jest to, że Bier i James znaleźli się wśród sygnatariuszy tego listu.

Wśród sygnatariuszy nie było za to Kevina Esvelta, który od czasu pierwszej swojej publikacji na ten temat stał się niesamowicie aktywnym adwokatem większej regulacji prawnej tej techniki. Esvelt podkreśla wciąż nie tylko zagrożenie płynące z nieostrożnego stosowania tej techniki i braku zastanowienia nad nieprzewidzianymi konsekwencjami wypuszczenia organizmów z aktywną reakcją mutageniczną na pozalaboratoryjną wolność; zwraca on też uwagę na przykład na potencjał zastosowania jej jako broni biologicznej. Dzięki tej jego aktywności, która w mijającym roku zaczęła wreszcie przynosić jakieś (chociaż wciąż nikłe) rezultaty, pismo Nature umieściło go na swojej końcoworocznej liście 10 badaczy, których działalność miała największe znaczenie w roku 2016.

O tym, jak niewiele trzeba, aby zaprojektować taką reakcję, przekonaliśmy się zresztą niedawno. W październiku odbyły się prezentacje zespołów konkurujących w tegorocznej edycji konkursu dla studentów iGEM – konkurs poświęcony jest biologii syntetycznej. Zespół z Uniwersytetu Minnesoty opisał stworzenie własnej mutagenicznej reakcji łańcuchowej. Młodzi adepci biologii wykazali się zresztą odpowiedzialnością, której pozazdrościć mogłoby im wielu dorosłych badaczy – w swoim projekcie uwzględnili na przykład środki bezpieczeństwa zaproponowane przez Esvelta. Niemniej jednak cała sytuacja napełnić może tyleż podziwem, co grozą (3).

W pierwszej połowie grudnia w Cancun odbyła się konferencja ONZ na temat bioróżnorodności. I na tej właśnie konferencji pojawiać się zaczęły coraz bardziej donośne głosy domagające się moratorium na stosowanie mutagenicznej reakcji łańcuchowej – podobne do głosów zaledwie rok wcześniej proszących o moratorium na redagowanie ludzkich komórek embrionalnych. Chociaż tym razem propozycja jeszcze przepadła, znajdując poparcie jedynie u części badaczy z niektórych krajów, oczekiwać można, że na kolejnej edycji tego spotkania ruch domagający się lepszej regulacji tej technologii będzie bardziej zorganizowany.

Trudno zresztą powiedzieć, czy moratorium – całkowity zakaz stosowania tej techniki – jest tutaj właściwym rozwiązaniem. Abstrahując już od tego, jak bardzo ograniczyłoby to możliwości walki z niektórymi chorobami, które przecież dość nagle otworzyły się przed światem naukowym, taki zakaz ograniczyłby też to, jak dobrze rozumiemy i umiemy kontrolować (w sensie fizycznym a nie legalnym) tę technikę. Kevin Esvelt, którego możnaby przecież podejrzewać o wsparcie tego ruchu oporu, jest przeciwny moratorium. Chciałby za to, aby od laboratoriów stosujących tę technologię wymagano większej przejrzystości, a także aby obowiązkowej rejestracji badań (w podobny sposób, w jaki dzisiaj rejestruje się na przykład próby kliniczne).

No i nie trzeba być geniuszem, żeby rozumieć, że Esvelt ma rację. Tylko studiując i stosując nowe narzędzie można nauczyć się z niego właściwie korzystać. Ale ta nauka też musi podlegać jakiemuś monitoringowi, który zapewni bezpieczeństwo wszystkim dookoła. Tym bardziej, że jeśli na mutagenicznej reakcji łańcuchowej swoje wstrętne łapska położy w końcu jakiś bioterrorysta (4), nasze lepsze zrozumienie, w jaki sposób ta reakcja działa, może być jedynym ratunkiem przed skutkami biologicznego ataku. Co do tego zaś, czy ta technologia – jak i inne zastosowania techniki CRISPR/Cas – zostanie prędzej czy później wykorzystana przez kogoś bez zahamowań moralnych, nie powinniśmy mieć raczej wątpliwości. Nie było chyba jeszcze w historii świata nigdy potencjalnie groźnego narzędzia, którego ktoś w końcu nie próbował wykorzystać jako broni. Nie jest to więc kwestia tego, czy to się stanie, ale raczej kiedy. I jedyne co możemy zrobić, to być na to gotowym. W międzyczasie zaś, w ramach zabijania nudy, być może uda nam się wytrzebić malarię, Zika i kilka innych niemiłych choróbsk.

Przypisy:

1. Austin Burt jako pierwszy zaproponował, że mutageniczna reakcja łańcuchowa może być zastosowana jako narzędzie w inżynierii genetycznej. Pomimo tego, że prace opisujące zastosowanie CRISPR/Cas do redagowania genomu były odległe wciąż o dekadę, badacze mieli już pierwsze narzędzia do redagowania genomu – bardziej drogie i toporne nukleazy z motywem palców cynkowych (których użycie do redakcji genów opisano po raz pierwszy w połowie lat 90’). Można zatem powiedzieć, że tych gdybań Burt nie wyssał z palca. Historia samego zjawiska – a można sobie przecież wyobrazić sytuację, w której taka reakcja mutageniczna występuje naturalnie, bez ingerencji człowieka – jest jednak znacznie dłuższa, a koncept po raz pierwszy opisano pod koniec lat 60’.
2. Trzeba pamiętać, że grupa Churcha była jednym z pionierów techniki CRISPR/Cas jako narzędzia do redakcji genów. Jej praca na ten temat pojawiła się w piśmie Science tego samego dnia, co praca Fenga Zhanga, która jest obecnie tematem rozprawy w sądzie patentowym. Patentowa bitwa między Zhangiem i Instytutem Broad, w którym badacz pracuje, a Uniwersytetem Kalifornijskim w Berkeley, gdzie pracuje Jennifer Doudna – kolejna badaczka mocno zaangażowana w rozwój CRISPR/Cas, zasługuje prawdopodobnie na odrębny wpis albo i dziesięć. Mały przyczynek do tej historii (która jednak wciąż dynamicznie sie rozwija) znaleźć można w moim wpisie z początku 2016 roku.
3. Pełną historię wraz z komentarzem przeczytać możecie na stronie STAT News, które donosiło o niej w połowie grudnia.
4. Wcześniej w tym roku technologia CRISPR pojawiła się jako potencjalne narzędzie terroru w raporcie amerykańskiego szefa wywiadu – pisałem o tym w lutym.