Wszyscy walczymy z Cas9

Od połowy grudnia zbieram się, żeby napisać kolejny wpis o odkryciach i wyczynach naukowych wyróżnionych w roku 2017. Czytelnicy, którzy widzieli może ranking wydarzeń w 2017 roku pisma Science albo listę najbardziej wpływowych ludzi w nauce w piśmie Nature, mogli zauważyć pewną powtarzalność pomiędzy tymi dwoma zestawieniami. To istotne dla mnie to obecność Davida Liu i jego nowej techniki redagowania genów na poziomie pojedynczych zasad.

O samej technice napiszę więcej wkrótce. To, co ważne jest dzisiaj, to to, że u jej podstawy – tak jak i u podstawy większości popularnych obecnie metod – leży system CRISPR/Cas9, o którym na blogu piszę względnie często. A chociaż mówiąc o tych metodach często skracamy nazwę jeszcze bardziej i nazywamy je technikami CRISPR, to prawdziwym koniem roboczym tego systemu jest białko Cas9.

Chociaż system opisywałem już tutaj (i gdzie indziej) wielokrotnie, powtórzę podstawy, bo są one istotne dla dalszej części tego wpisu. Narzędzie do redakcji genów CRISPR/Cas9 składa się – na najbardziej podstawowym poziomie – z dwóch elementów: elementu zbudowanego z kwasu rybonukleinowego, CRISPR, oraz białka Cas9. CRISPR w kontekście już samej techniki jest zresztą nazwą błędną, ponieważ odnosi się do sekwencji DNA, która jest częścią bakteryjnego „układu odpornościowego”, zaadaptowanego następnie na potrzebny biotechnologii. W rzewistości fragment kwasu nukleinowego wchodzący w skład systemu biotechnologicznego, to syntetyczny fragment RNA (tzw. sgRNA), który składa się z kilku części. Jedną jest fragment odpowiedzialny za rozpoznanie sekwencji DNA, którą chcemy wziąć na celownik; kolejną – fragment, dzięki któremu poprzez sgRNA z naszym DNA wiąże się białko Cas9.

Jak się łatwo domyślić, ponieważ sgRNA służy do rozpoznania poszukiwanej sekwencji w genomie, jest dokładna budowa zależy od tego, jakim genem jesteśmy zainteresowani. Niezmiennym składnikiem technologii jest natomiast białko Cas9, które jest odpowiedzialne za redakcję DNA – ponieważ to Cas9, a nie sgRNA, posiada aktywność katalityczną.

Cas9 jest endonukleazą DNA, co oznacza, że potrafi ciąć kwas nukleinowy. Z drugiej strony ma też zdolność wiązania się do DNA w ściśle określonym miejscu, jeśli obecne jest naprowadzające RNA (sgRNA). To oznacza, że w swojej najczystszej, niezmienionej formie Cas9 jest idealnym narzędziem do modyfikowania DNA (w sensie wprowadzania fizycznych zmian w jego sekwencji). Okazuje się jednak, że już sama jego zdolność do programowalnego wiązania się do DNA jest niesamowicie użyteczna. Obecnie liczne już badania pokazały możliwości wykorzystania nieaktywnego białka Cas9 – dCas9, w którym domena katalityczna po prostu nie działa. Po pierwsze, już samo zastosowanie dCas9 w połączeniu z sgRNA pozwala na selektywne wyciszanie genów: dCas9 wiąże się do wybranego genu, blokując dostęp do DNA enzymów odpowiedzialnych za transkrypcję. Po drugie, dCas9 może zostać sprzężone z inną domeną katalityczną, która odpowiada na przykład za metylację DNA – w ten sposób za pomocą Cas9 dokonujemy już nie tyle redakcji genomu, co epigenomu (pouczająca i otwarcie dostępna przeglądówka, dla chętnych, którzy żargonu się nie boją, jest tutaj).

I można tak wymieniać dalej. Istotne jest tutaj po prostu to, że białko Cas9 jest w epicentrum zainteresowania, jeśli chodzi o zastosowania systemu CRISPR/Cas9 do w zasadzie czegokolwiek. A jedne z najbardziej dla nas ważnych i interesujących zastosowań, to oczywiście te terapeutyczne – w terapii genowej.

Terapia genowa też przeżywa obecnie renesans, chociaż to akurat nie jest wcale aż tak wielką zasługą ceny i łatwości obsługi CRISPR/Cas9 (nie jestem nawet pewien, czy system ten został w ogóle zastosowany klinicznie do tej pory), a jest raczej wynikiem tego, że lata rozwoju starszych technik zaczęły przynosić rezultaty w postaci terapeutycznych sukcesów – jeden taki sukces znalazł się zresztą także na obu podsumowujących rok 2017 listach.

Niemniej jednak oczekiwania podążąją raczej w kierunku docelowego stosowania CRISPR/Cas9 w celach terapeutycznych (publicznie jest zarejestrowanych sześć prób klinicznych, które obecnie rekrutują pacjentów do testowania terapii opartych na CRISPR/Cas9 – pięć z nich odbywa się w Chinach, a jedna w Stanach Zjednoczonych). Dlatego z pewnym niepokojem w zeszłym tygodniu zwróciłem uwagę na pracę, która pojawiła się na serwerze preprintów bioRxiv (preprint – nowe ulubione słowo).

Manuskrypt opisuje wyniki badań prowadzonych w grupie Matta Porteusa z Uniwersytetu Stanforda, która zajmuje się przede wszystkim właśnie terapeutycznymi zastosowaniami redagowania genomu. Badacze postanowili następującą hipotezę: dwa najczęściej stosowane homologi Cas9 pochodzą z gatunków bakterii, które są patogenami ludzkimi – gronkowca złocistego oraz paciorkowca S.pyogenes. Oznacza to, że ludzki organizm jest wystawiony na te bakterie – a co za tym idzie, ich „zawartość”. Więc założyć można, że ludzki organizm posiadać będzie przeciwciała rozpoznające ten enzym.

Nie jestem co prawda pewien, czy rozpoznawania enzymu, który nie jest białkiem występującym na powierzchni bakterii, jest taką oczywistą oczywistością (chociaż jeśli jest, to może mnie jakiś mikrobiolog prędko poprawi), ale można zapewne oczekiwać, że ludzki organizm wyprodukuje też przeciwciała przeciw białkom obecnym wewnątrz komórek bakteryjnych, które mogą być uwolnione na przykład podczas rozpadu martwych komórek bakteryjnych.

Jaka by ta hipoteza nie była, ważne jest, jakie były wyniki jej testowania. Badacze przebadali próbki od zdrowych ochotników na obecność przeciwciał przeciwko białku Cas9. Okazało się, że obecne są one w dwóch trzecich próbek dla Cas9 pochodzącego z gronkowca, i w 40% próbek dla Cas9 pochodzącego z paciorkowca. Sprawdziwszy, że da się wykryć takie przeciwciała, naukowcy postanowili przetestować też, czy da się może wykryć białe krwinki będące w stanie wykrywać Cas9 – okazuje się, że owszem.

Co to dla nas oznacza w kontekście stosowania CRISPR/Cas9 do naprawy genów? Otóż może to oznaczać, że wielu z nas posiada wrodzoną odporność na najważniejszy element tego systemu!

Badacze podkreślają, że przy obecnym stanie wiedzy i dla obecnych sposobów stosowania tej techniki nie jest to koniecznie poważny problem. Terapia genowa w chwili obecnej jest terapią lokalną: najczęściej polega na wprowadzeniu elementów systemu do komórek pobranych od pacjenta, które następnie selekcjonowane są pod kątek występienia pożądanych zmian i transplantowane z powrotem pacjentowi. Oznacza to, że na żadnych etapie białko Cas9 nie jest wystawione na działanie naszego układu odpornościowego.

Z drugiej jednak strony martwić można się obecnością białych krwinek rozpoznających Cas9 – oznacza to bowiem, że nasze własne komórki mające jakiekolwiek oznaki obecności tego białka (czy to wbudowanego, celowo, do genomu; czy to wprowadzonego w formie peptydu) mogą paść ofiarą odpowiedzi układu immunologicznego, który bardzo efektywnie usunie z organizmu dopiero co „naprawione” komórki. Problem tutaj byłby dwojaki: po pierwsze, trudno przewidzieć, jak wpłynie to na bezpieczeństwo tych terapii. Po drugie zaś, taka wrodzona odporność może w znaczącym stopniu wpłynąć na ich efektywność.

Na koniec warto jednak podkreślić, że nawet ci spośród nas, którzy posiadają przeciwciała przeciwko gronkowcowemu lub paciorkowcowemu Cas9, nie są jeszcze na straconej pozycji. Jednym z najważniejszych kierunków rozwoju tej technologii jest ciągłe poszukiwanie nowych, lepszych enzymów, lub modyfikacja tych istniejących.

I tak trwają na przykład badania mające na celu izolację enzymu Cas9 z innych bakterii, z których wiele nie tylko nie powoduje u ludzi poważnych infekcji, ale często nie występuje nawet w środowiskach, w których mamy szanse je spotkać. Innym podejściem jest poszukiwanie innych enzymów o aktywności katalitycznej podobnej do Cas9 – chociaż jedynym znanym mi przykładem, który możnaby nazwać w jakimkolwiek stopniu sukcesem było odkrycie, że Cas9 może być zastąpione przez białko Cpf1. Wielu badaczy próbuje też modyfikować Cas9 metodami bioinżynierii – i trudno przewidzieć, w jakim stopniu takie zmiany mogą wpłynąć na rozpoznawanie tych białek przez nasz układ odpornościowy.

Jednak firmy pracujące nad technicznymi rozwiązaniami (głównie bioinżynieryjne spinouty instytucji uwikłanych obecnie w patentową batalię wokół systemu CRISPR/Cas9), będą musiały mocno się napracować, aby znaleźć w tej sytuacji rozwiązanie, które pozwoli im uniknąć powtórki z kazusu Jessego Gelsingera, który w 1999 roku zmarł w trakcie prób klinicznych terapii genowej, czy niedawnych perypetii firmy Juno Therapeutics testującej terapię antynowotworową CAR-T (ta sytuacja jest nieco bardziej skomplikowana, ale dotyczy również terapii wykorzystującej modyfikowane genetycznie komórki).